[发明专利]一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组及应用

说明书

本发明公开了一种鉴定西瓜杂交种纯度的方法及其使用的SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由8个引物组组成；每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点；各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所示。该SNP引物组合可在西瓜杂交种的种子或幼苗期进行早期鉴定，保证杂交种的纯度，切实保护生产者和育种家的权益，并为西瓜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)原产非洲地区，属于葫芦科西瓜属一年生蔓生草本植物，其果实味甜多汁、富含多种营养成分，在热带、亚热带地区广泛栽培。我国是西瓜的生产大国和消费大国，自20世纪80年代西瓜杂交一代品种在我国普及推广以来，西瓜栽培面积迅速扩大，用种量和相应品种也越来越多。目前，全国通过鉴定、认定、登记的西瓜品种达1100多个，而在市场上的销售的西瓜品种数量远超这一数字。但在售西瓜种子质量参差不齐，其中一个较为突出的问题就是种子纯度不达标，这给之后西瓜生产造成了严重损失。传统种子纯度鉴定主要通过种子形态鉴定、田间表型鉴定等，周期长且费工费时，同时受主观和环境因素影响较大，准确性难以保证。

依据农作物种子质量标准(GB16715.3--2010)的规定，西瓜三倍体杂交种二倍体杂交种和西瓜三倍体杂交种的纯度不低于95％。而国际上一流的西瓜种业公司因其严格的质量管理和纯度鉴定体系，其要求上市的种子纯度接近100％。因此，尽快开展纯度鉴定是种子上市前的必然要求，同时纯度鉴定结果也是种子生产质量控制和交易的重要依据。

常用的种子纯度鉴定方法有形态学鉴定和分子鉴定。传统的形态学鉴定易受环境、气候和人为因素的影响，且存在费时费地费力等缺点。利用分子标记技术能够从DNA水平上检测杂交种和亲本之间的差异，克服了空间的限制，极大缩短了检验所需时间。同时值得注意的是，根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种DUS测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交DNA检测结果。因此，基于DNA水平的分子标记检测鉴定种子纯度是快速和可靠的，是西瓜种业检测的发展趋势所在。

目前品种纯度鉴定可用的分子标记有RAPD标记、SRAP标记、SSR标记等，尤其SSR标记在纯度鉴定方面较为常用。如利用SSR引物对京欣1号、京欣2号、京欣3号、京欣无籽1号、京秀、暑宝和航兴天秀1号进行的纯度鉴定(牛茜等，2014)；对上海农科院的5个西瓜品种：申选958、双色冰淇淋、黄晶、圣女红3号进行种子纯度的鉴定(李超汉等，2015)；对天津市静海区主要种植的8424类型西瓜品种蜜多进行的纯度鉴定(焦荻等，2019)等。国内技术专利方面，如申请号为CN201410788486.X，于2016年9月28日公告的专利，其找到了SSR引物QYXG3或QYXG7，利用此引物刻对西瓜杂交品种荃抗绿霸进行纯度鉴定。CN201510136245.1，于2017年10月31日公告的专利，其找到了一对SSR引物可用于西瓜品种红和平杂交种的纯度鉴定。申请号为CN201610616215.5，于2019年12月3日公告的专利，其利用SSR和Indel标记组合，采用双重PCR技术对小型西瓜品种琼丽的纯度进行鉴定，提高了检测准确性。其他还包括其他一系列已公开专利中使用SSR引物对博琳、安德、天福二号、黄凤凰、安然、丰华21杂交种子纯度鉴定和使用RAPD引物对苏蜜6号、苏蜜9号进行纯度鉴定的方法等。这些技术简单易行、快速准确、费用低，具有应用价值。

但目前已报道或公开的技术和相关引物，其可应用的品种仍然较少，最多的只有7个品种。这远远达不到我国当前西瓜市场销售品种的种子纯度鉴定要求。另外受限于SSR检测方式，其检测时极易导致不真实、假阳性、假阴性的结果，因此不能适应自动化、高通量、大规模的检测时对准确性和稳定性的要求。