[发明专利]巨噬细胞分离用组合试剂及其应用

权利要求书

1.一种巨噬细胞分离用组合试剂，其特征在于组成为：心脏消化液A（A液）: 0.02g-0.05g Ⅱ型胶原酶，0.01g Ⅳ型胶原酶，0.02g-0.05g BSA加入50mL PBS缓冲液中；缓冲液B（B液）: 无钙镁HBSS缓冲液中加入1 wt.%-3wt.%的血清。

2.根据权利要求1所述巨噬细胞分离用组合试剂，其特征在于具体组成为：心脏消化液A（A液）: 0.03g Ⅱ型胶原酶，0.01g Ⅳ型胶原酶， 0.03g BSA加入50mL PBS缓冲液中；缓冲液B（B液）: 无钙镁HBSS缓冲液中加入2wt.%的血清。

3.权利要求1或2所述巨噬细胞分离用组合试剂的应用，其特征在于：将小鼠进行麻醉，麻醉后将小鼠心脏灌流，当小鼠心脏中的血液清除后将小鼠心脏取出放入B液中，将心脏组织修剪为1mm³的组织块，修剪完毕后用 PBS缓冲液冲洗，冲洗完成后将小鼠心脏装入10 mLEP管中，加入A液进行消化；消化结束后将心脏组织消化液使用300 g离心5分钟，离心结束后弃上清，使用3 mL PBS将沉淀重悬，依次加入1 mL去碎片试剂与4 mL PBS缓冲液，300 g离心5分钟, 所述去碎片试剂为Debris Removal Solution；离心结束后将带有细胞碎片的悬浊液弃去，加入500 μL C液将沉淀重悬，并加入避光的1.5 mL EP管中，所述C液为0.03gⅡ型胶原酶加入50mL PBS缓冲液中；向细胞悬液中加入CD45、CD11b、F4/80以及死活细胞染料的流式抗体，在4℃转盘上旋转孵育抗体30分钟，抗体孵育结束时加入1 mL C液后300 g离心5分钟，使用PBS缓冲液重悬细胞清洗后300 g离心5分钟，离心结束后弃去PBS，使用300μL B液对细胞进行重悬后加入流式管中进行流式细胞术分选巨噬细胞。

4.根据权利要求3所述巨噬细胞分离用组合试剂的应用，其特征在于：所述消化方法为向10 mL EP管中加入2 mL A液在37℃恒温摇床中使用150转速进行心脏组织消化；首次消化20分钟后将消化液吸出经70 μm滤网过滤后加入置于冰上的15 mL离心管中；接下来向剩余组织中加入2 mL A液，37℃恒温摇床消化10分钟后吸出消化液经滤网过滤并加入上述离心管中，此步骤重复4次。