[发明专利]用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用

说明书

本发明公开用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用，所述用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明的特异性实验结果表明该本发明的引物对只在二尖梅奇酵母中有特异性片段，而与其他常见的几种酵母菌、细菌均无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏度实验表明，该引物组检测二尖梅奇酵母的最低限度为8.62×10个/μL，具有良好的敏感性。本发明的提出为二尖梅奇酵母病的检测或诊断提供了一种有效技术手段，通过本发明的方法，使二尖梅奇酵母的检出方法更简便，诊断更精确，对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、大鳞大麻哈鱼(Chinook salmon)等经济养殖物种的二尖梅奇酵母病的防控具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用。

背景技术

二尖梅奇酵母是水产动物致病酵母菌的一种，可以侵染多种经济养殖物种，如中华绒螯蟹、罗氏沼虾、大鳞大麻哈鱼等。二尖梅奇酵母可以在多种水生动物体内各组织中大量繁殖发育，并引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变，造成其机体细胞肿胀、糜散、坏死，严重时会导致其死亡。严重威胁经济水生动物的健康养殖，给其养殖产业造成了很大影响。

目前，水生动物感染二尖梅奇酵母通过临床诊断难以确诊。目前常规的检测方法是形态学检测，而二尖梅奇酵母个体微小，不易于观察，无特异性引物，其他酵母通用引物灵敏性和特异性均较低，容易造成误检。

综上，目前缺乏对二尖梅奇酵母检测的方法，亟待进一步改进。

发明内容

为此，本发明提供用于检测二尖梅奇酵母的引物对及其应用，以解决现有技术中二尖梅奇酵母过程复杂，灵敏度、特异性低的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于检测二尖梅奇酵母的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的一个实施例中，所述引物对用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示的二尖梅奇酵母HYR3基因。

本发明还提供上述特异性引物对在如下任一中的应用，

(1)制备PCR扩增二尖梅奇酵母HYR3基因片段的试剂或试剂盒；

(2)制备检测二尖梅奇酵母的试剂或试剂盒。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的PCR体系为：反应体系15μL：2×TaqMaster Mix，13μL；上游引物及下游引物，各0.5μL；模板，1μL。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的PCR反应条件为：预变性94℃，10min；变性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。

本发明的一个实施例中，所述试剂或试剂盒的最低检测限度为8.62×10¹个/μL。

本发明具有如下优点：

本发明根据针对二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidate)的特异性片段IFF11、HYR3、IFF8的基因保守序列，分别设计并筛选出三对特异引物，并筛选出第一特异性引物对，其具有特异性、灵敏性良好的优点，用于二尖梅奇酵母的检测或诊断。并建立了相关检测方法，通过PCR检测，可以快速准确地检测虾蟹中二尖梅奇酵母的感染情况，使二尖梅奇酵母的检出率极大提高，诊断更精确，具有广阔的应用前景，对于各种水产动物二尖梅奇酵母病的防控和水产健康养殖都具有重要意义。