[发明专利]探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种探针及其制备方法和应用。该探针包括核酸片段，核酸片段通过多臂修饰性PEG标记有荧光物质。核苷酸通过多臂修饰性PEG实现PEG化，多臂修饰性PEG的修饰基团与荧光物质发生偶联反应从而使荧光物质标记到核酸片段上。以此形成的探针中，单个核苷酸有多个修饰基团形成的偶联位点，更多的偶联位点可以结合更多的荧光物质。因而，标记后的探针其单位长度上的荧光物质更多，检测时表现出的荧光强度更高，从而能够有效提高检测的灵敏度和精确性。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，尤其是涉及一种探针及其制备方法和应用。

背景技术

荧光原位杂交(Fluorescent in situ Hybridization，FISH)检测是临床病理检测中广泛运用的一种分子诊断技术，用来检测染色体上的特定基因的表达和定位异常，其在疾病的诊断、靶向药物治疗及预后预测等方面发挥巨大作用。荧光原位杂交的主要原理在于通过不同方法用荧光染料标记单链DNA探针(与靶基因片段互补)作为荧光标记杂交探针，按照碱基互补配对原则，探针可与组织或细胞中待检测的染色体上的靶基因特异结合，染色体变性后退火即可形成靶基因与荧光标记探针的双链结构。随后在荧光显微镜下对待测靶基因进行定性、定量或相对定位分析。

在进行荧光原位杂交的实验时，需要排除自发背景荧光的干扰。组织自发荧光的来源包括组织本身的成分(如黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞和脂褐素)以及组织固定液(如福尔马林、多聚甲醛)等，这些组分会在可见光谱的绿色和黄色等波长范围内产生与目的信号无关的背景荧光，从而干扰荧光染料(如荧光素和Alexa Fluor488等)的发光信号，影响对组织切片靶标信号的检测和辨别。在这种情况下，研究人员尝试通过时间分辨荧光技术来解决这一问题。时间分辨荧光的技术基于稀土离子配合物进行设计，这些稀土离子配合物的荧光寿命更长，可以达到1～2ms，是传统荧光物质的10³～10⁶倍，因此，通过设置时间延迟可以得到无背景荧光的时间分辨荧光信号。

探针的时间分辨荧光标记是通过把稀土离子配合物荧光标记的核苷酸引入探针或者通过稀土离子配合物自身的活性基团引入另一活性基团标记的核苷酸探针来实现。根据引入的过程不同，标记方法可以分为缺口平移法(nick translation)、随机引物法、PCR法等。缺口平移法是由脱氧核糖核酸酶I(DNase I)在核酸链上产生随机缺口，然后由聚合酶的5′→3′外切酶移除5′缺口端的核苷酸，然后通过聚合酶的5′→3′聚合酶活性将标记的核苷酸掺入到新合成的核酸探针。随机引物法是以变性后的DNA单链为模板，随机引物与DNA单链结合，通过聚合酶的作用把荧光标记的核苷酸引入核酸探针。PCR法则是通过PCR技术将荧光标记的核苷酸掺入特定引物之间的核酸探针。然而，目前在探针中引入稀土离子配合物荧光标记核苷酸(Lanthanide Complex-dNTP)的效率较低，导致标记探针的荧光强度较弱，较弱的荧光强度对原位杂交荧光信号的检测提出了更高的要求。基于此，有必要提供一种具有更高荧光强度的探针。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有更高荧光强度的探针及其制备方法和应用。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种探针，该探针包括核酸片段，核酸片段通过多臂修饰性PEG标记有荧光物质。

本发明实施例的探针至少具有如下有益效果：

核苷酸通过多臂修饰性PEG实现PEG化，多臂修饰性PEG的修饰基团与荧光物质发生偶联反应从而使荧光物质标记到核酸片段上。以此形成的探针中，单个核苷酸有多个修饰基团形成的偶联位点，更多的偶联位点可以结合更多的荧光物质。因而，标记后的探针其单位长度上的荧光物质更多，检测时表现出的荧光强度更高，从而能够有效提高检测的灵敏度和精确性。