[发明专利]一种猪ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法

说明书

本发明公开了一种猪ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，包括构建ACE2真核表达载体，转染CHO细胞，通过G418筛选出稳定表达的pcDNA.3.1(+)‑ACE2细胞株，获得具有生物学活性的ACE2蛋白。本发明具有：①快速：仅需1小时反应时间；②简单：不受片段酶切位点的影响，无需酶切；③高效：阳性率达95％以上；④无缝：不引入额外序列等优点。ACE2通过靶向降解AngII发挥舒张血管、抑制炎症及抗纤维化等多种机体保护功能；同时作为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS‑CoV)的功能性受体，其临床意义非凡。本发明为深入研究猪ACE2作为潜在的病毒受体在猪冠状病毒感染中发挥的生物学功能及分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种猪ACE2(Angiotensin converting enzyme2)真核表达重组质粒载体的构建、鉴定并获得稳定过表达ACE2基因的细胞株方法。

背景技术

血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000年首次报道的一种单羧肽酶，作为肾素-血管紧张素系统的关键调控蛋白，对维持机体全身或局部多种组织器官的功能稳态具有重要意义。近年来的研究发现，ACE2在抑制肠道炎症、协助肠道物质转运、维持肠道稳态方面意义重大。ACE2能促进氨基酸和葡萄糖等物质转运载体的表达，协助其在肠道内的吸收转运来维持肠道内环境的平衡。2003年，研究发现ACE2是急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)的主要功能性受体，具有介导SARS-CoV入侵和细胞融合等作用，SARS-CoV通过病毒颗粒外膜上的S蛋白与敏感细胞表面的ACE2受体结合进入宿主细胞；2019年，研究发现SARS-CoV-2与SARS-CoV一样，也是通过识别ACE2蛋白进入宿主细胞的，ACE2是COVID-19侵入人体的关键。

根据病毒溯源研究证明，SARS-CoV、SARS-CoV-2等冠状病毒均以动物作为自然宿主或中间宿主，因此，对动物ACE2受体功能的研究有助于解释该病毒的跨种感染机制。迄今，人、大鼠、小鼠、绵羊、家猫、鸡以及斑马鱼等多种动物ACE2基因的详细序列已于GenBank上公布。但与畜牧生产相关的动物，特别是ACE2在猪上的研究很少，生物学功能尚不明确。

在本发明研究中，拟以苏姜猪为研究对象，应用RT-PCR和基因克隆技术从苏姜猪十二指肠组织扩增ACE2基因，通过T4DNA连接酶连接到真核表达载体pcDNA.3.1(+)，在CHO细胞中通过G418和单克隆筛选获得稳定表达pcDNA.3.1(+)-ACE2的细胞株，以获得具有生物学活性的ACE2蛋白，为深入研究ACE2作为潜在病毒受体在猪冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一猪ACE2真核表达重组质粒载体pcDNA3.1(+)-ACE2构建、鉴定与表达方法，目的在于：①用它作为运载工具，将目的基因ACE2转移到宿主细胞中去；②利用它在宿主细胞内对目的基因ACE2进行大量的复制(称为克隆)，为深入研究ACE2作为潜在病毒受体在猪冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。其具体技术方案为：

一种猪ACE2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：