[发明专利]一种神秘果素重组蛋白及其表达与纯化方法

权利要求书

1.一种神秘果素重组蛋白，其特征在于，所述神秘果素重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1，核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种如权利要求1所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述表达与纯化方法使用的神秘果素重组蛋白表达载体的羧基端带有FLAG标签。

3.根据权利要求2所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述表达与纯化方法包括PCR反应，所述PCR反应使用的正向引物序列为SEQ ID NO.4，反向引物序列为SEQ ID NO.5。

4.根据权利要求3所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述表达与纯化方法使用的基因工程菌为大肠杆菌Origami(DE3)。

5.根据权利要求4所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述表达与纯化方法包括以下步骤：

S1、合成重组蛋白基因质粒：将所述神秘果素重组蛋白的基因克隆至pUC57质粒载体中，获得质粒pUC57-miraculin；

S2、构建神秘果素重组蛋白表达载体：将合成的质粒pUC57-miraculin通过PCR反应进行扩增，获得所述神秘果素重组蛋白的基因扩增产物；使用SpeⅠ和HindⅢ双酶分别酶切所述神秘果素重组蛋白的基因扩增产物和pET22b-FLAG载体质粒，得到所述神秘果素重组蛋白的基因片段和带有FLAG标签的载体质粒片段，并将两者连接，得到神秘果素重组蛋白的表达载体pET22b-miraculin-FLAG；

S3、诱导神秘果素重组蛋白表达：将构建好的pET22b-miraculin-FLAG表达载体质粒转入基因工程菌大肠杆菌Origami(DE3)中，获得表达miraculin-FLAG重组蛋白的工程菌，接种并培养后，加入IPTG，然后继续培养；培养结束后，收集细菌，获得菌体的细菌裂解液；

S4、纯化所述步骤S3中的细菌裂解液，得到所述神秘果素重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，得到所述神秘果素重组蛋白的基因片段和带有FLAG标签的载体质粒片段，并将两者连接后，进行初筛得到所述神秘果素重组蛋白的表达载体pET22b-miraculin-FLAG；所述初筛的具体步骤包括：

将所述神秘果素重组蛋白的基因片段和带有FLAG标签的载体质粒片段连接后得到的载体质粒转入DH5α大肠杆菌中，进行培养；培养后收集DH5α大肠杆菌提取质粒，进行双酶切，其中，使用的限制性内切酶分别为SpeⅠ和HindⅢ，将酶切产物分别进行电泳分析，得到两个条带；进一步测序，将测得的核苷酸序列与所述核苷酸序列SEQ ID NO:2进行比对，若所述测得的核苷酸序列中具有与所述核苷酸序列SEQ ID NO:2重合的序列段，则所述质粒为神秘果素重组蛋白的表达载体pET22b-miraculin-FLAG。

7.根据权利要求5所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述步骤S3的诱导神秘果素重组蛋白表达的条件为，加入IPTG后，在18℃、220转/分钟的条件下摇晃培养12h。

8.根据权利要求5所述的神秘果素重组蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述步骤S4中的纯化方法为，采用FLAG标签蛋白纯化磁珠对所述神秘果素重组蛋白进行纯化。