[发明专利]一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法

说明书

本发明公开了一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法，在林可链霉菌中组合敲除Lrp家族转录调节基因SLCG_4846和TetR家族转录调节基因SLCG_2919获得的。同时，本发明还公布了一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法。该方法通过同源重组技术依次对多个基因进行无痕敲除，此过程不引入抗性基因，既降低了发酵成本，也保证了遗传的稳定性。同时，该过程并不影响菌体生长，最重要的是，可在同一菌株中连续进行多次敲除实验。本发明可大幅度提高林可霉素产量，为工业生产提高林可霉素产量提供新的技术支持。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法。

背景技术

抗生素是一类可抑制致病菌生长的次级代谢产物，其半数以上的产生菌是链霉菌。本发明所涉及的林可链霉菌属于链霉菌的一种，所产抗生素为林可霉素，在临床上主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，其衍生物克林霉素在治疗细菌感染尤其是厌氧菌感染方面效果更佳。

林可链霉菌的遗传改造从未间断，传统的诱变方法不但耗时，随机性也较大，并不适合进一步进行遗传改造。二十一世纪以来，新颖高效的基因工程技术，如大片段同源重组、Cre/loxP以及CRIPSR/Cas 9，为遗传改良林可链霉菌提高林可霉素生物合成的产量带来了机遇。

林可霉素是由丙基脯氨酸(PPL)和林可酰胺(LSM)缩合后修饰形成的，在此过程中受多种调控因子作用。近年来，已发现多种调控因子，如Lrp、TetR、BldD、LmbU、BldA和AdpA，调控林可霉素的生物合成。然而，较其它抗生素而言，林可霉素的生物合成调控研究还比较有限，不利于定向改造林可链霉菌获得高产菌株。本发明目的就是通过基因工程途径组合敲除两个调控基因来获得林可霉素高产菌株，用于林可霉素或中间产物生产，并为改造多个调控基因奠定基础。

Lrp(leucine-responsive regulatory protein)家族是一类广泛存在于细菌和古细菌中的转录调控因子，参与控制微生物菌毛生成、重金属转运、多肽运输、能量代谢等多种重要的生理过程。近年来报道了放线菌多种Lrp/AsnC家族转录调控子参与抗生素产量和形态分化，比如BkdR、SCO2140、SACE_Lrp、SCO3361、SACE_5717、SLCG_Lrp等，暗示着Lrp家族调控基因在放线菌抗生素生物合成中的重要性。

TetR家族转录调控因子(TetR Family Transcriptional Regulators，TFRs)在调控抗生素的生物合成、菌体的形态分化、药物外排、初级代谢、群体感应和应对渗透胁迫等生理过程中发挥着重要作用。近年来报道了多种参与抗生素产量和链霉菌形态分化有关的TFRs，如SAV_576、SAV_3619、SCO_1712、AtrA、SLCG_2919等，暗示着TetR家族调控基因在链霉菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。

发明内容

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法，进一步提高林可霉素的产量，获得林可霉素高产菌株。在林可链霉菌的基因组中含多个编码Lrp家族转录调控因子的基因，同时对这些基因进行敲除实验后发现：缺失SLCG_4846基因后，菌株的林可霉素产量较出发菌株提高了23％。在缺失突变株中回补SLCG_4846基因，林可霉素产量恢复至出发菌株水平，表明SLCG_4846负向调控林可霉素的生物合成。之后在工业菌株LA219X中敲除SLCG_4846，突变株产量显著提高，增幅达11.5％。

本实验室前期发现TetR家族转录调控因子SLCG_2919对林可霉素的生物合成具有负调控效应。

为进一步提高林可霉素产量，本发明对SLCG_4846和SLCG_2919这两个调控因子进行了组合改造，获得了双敲菌株LA219XΔ4846-2919。