[发明专利]一种适合甘蔗的植物表达载体的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种植物表达载体在用基因枪法遗传转化甘蔗中的应用，其特征在于，所述植物表达载体的构建包括以下步骤：

（1）扩增ubi启动子目的序列：以EcoRI-BamHI为插入位点并合成引物， PCR扩增，得到目的片段，所述引物序列为：

M1300R:5’- GCACCCCAGGCTTTACAC-3’

PL515R:5’-CGCGGATCCTCCCCGCGGTAGACTAGTCCGGGTACCGAGCTCGTA-3’；

（2）以pCAMBIA1300-MCS-E9 ter为载体骨架，分别对目的片段与载体骨架进行酶切，得到EcoRI-BamHI酶切的目的片段、EcoRI-BamHI酶切的载体；将EcoRI-BamHI酶切的目的片段与EcoRI-BamHI酶切的载体进行体外连接得到连接产物，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，得到转化后的载体；

（3）将转化后的载体划线挑单菌落，通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性菌液；对阳性菌液进行测序，并进行质粒酶切验证，得到植物表达载体pHU；

所述步骤（1）中PCR反应程序为：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min10s，共30个循环；68℃延伸5min；

所述步骤（1）中PCR反应体系为10μM的上下游引物各2μL、模板DNA 1μL、2mM的dNTP 10μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25uL、1U/μL的KOD FX Neo 1μL、ddH₂O 9μL、Total 50μL；

所述步骤（2）中将连接产物转化至DH5α感受态细胞中的具体操作为：

①取出100μL的DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

②取一个EP管，置于冰上，加入80μL预冷的DH5α感受态细胞，然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

③冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

④加入500μL不含Kan的LB液体培养液到EP管中，混匀，置于摇床中在160r/m、37℃下培养1h；

⑤取出EP管，2000～3000r/m离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；

⑥37℃恒温培养箱中培养16～20h。