[发明专利]一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法

说明书

本发明涉及蛋白表达技术领域，公开了一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法，利用信号肽标记的TPO基因和分子伴侣的共表达作用，筛选出高表达，高性能的TPO，可以广泛的用于临床实验。

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及一种增加人甲状腺过氧化物酶产量试剂和的表达方法。

背景技术

甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来。

自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)是由T细胞介导的器官特异自身免疫性疾病，患者血清内存在多种针对甲状腺抗原的自身抗体，甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)就是其中最重要的一种，普遍存在于自身免疫性甲状腺疾病中，血清中甲状腺过氧化物酶抗体水平的测定，是对自身免疫性甲状腺疾病高危人群筛查、诊断和治疗的有效手段。因此，TPO-Ab水平的检测可用于对甲减、AITD等甲状腺疾病的诊断、病程进展、用药和愈后观察；且TPO-Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴别诊断的首选指标，因此表达量高、性能优良的TPO蛋白，对于制作高效、低成本的甲状腺疾病检测试剂盒的开发显得尤为重要。

目前，国内外所用的抗原都来自进口，成本较高，且较难订货，现有技术多用传统杆状病毒制备重组TPO，再导入昆虫细胞中进行表达，但往往存在表达量低、折叠不充分的问题，会影响后续检测阳性率，难以用于临床检测。

发明内容

为了解决TPO在昆虫细胞中表达产量低、折叠不充分，影响后续检测阳性率的问题，本文介绍一种可以满足市场需求的高产量、高质量和低成本的方案。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的试剂，包括信号肽和分子伴侣。

优选地，所述信号肽包括Pepidyl glycine alphaamidatingmonooxygenase(PAM，SEQ ID NO：1)、DBip(SEQ ID NO：2)、Melittin(SEQ ID NO：3)和GP64(SEQ ID NO：4)。

优选地，所述分子伴侣为Bip(SEQ ID NO：8)、PDI(SEQ ID NO：9)、Calnexin(SEQID NO：10) 或HSP70(SEQ ID NO：11)中的一种或几种。

更优选地，所述分子伴侣为Calnexin。

本发明的另一方面提供了一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的方法，包括

A、信号肽标记的TPO转入病毒细胞，制作TPO病毒；

B、分子伴侣转入病毒细胞，制作分子伴侣病毒；

C、将步骤A所述的TPO病毒和步骤B所述的分子伴侣病毒导入昆虫细胞中进行表达，得TPO蛋白。

可选地，所述步骤A之前可以包括信号肽的筛选过程，即将N端添加信号肽的TPO基因构建到载体中，转入DH10bac细菌中进行蓝白班筛选和PCR验证，提取正确细胞的bacmid质粒。所述信号肽筛选之后，将正确细胞的bacmid质粒，即信号肽标记的TPO，转入病毒细胞进行TPO病毒制作。

上述信号肽的筛选过程可以确保TPO蛋白顺利表达，并筛选表达量最高的信号肽进行步骤A。

优选地，所述步骤B分子伴侣病毒的制作具体过程为，合成分子伴侣序列并将其构建到载体中，转入DH10bac细菌中进行蓝白班筛选和PCR验证，提取正确细胞的bacmid质粒，转入病毒细胞进行分子伴侣病毒制作。