[发明专利]利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞表达病毒蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体，得到重组载体A；

(2)将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体，得到重组载体B；

(3)将步骤(1)得到的重组载体A和步骤(2)得到的重组载体B转染至宿主真核细胞中进行表达，得到目的蛋白。

2.根据权利要求1所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于还包括如下步骤：

(4)检测：

A)收集转染后的细胞，冻融，得到检测样品；通过对目的蛋白的检测，评估利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统的表达效率；

B)当目的蛋白为荧光蛋白时，可选择通过荧光强度的观察初步评估利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统的表达效率。

3.根据权利要求1或2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的NP868R帽状酶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(1)中所述的构建的方式通过同源重组将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体；

步骤(1)中所述的含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体为pXIP-myc-K1ERNAP；

所述的载体pXIP-myc-K1ERNAP通过如下步骤制备得到：将序列如SEQ ID NO.2所示的myc-K1ERNAP-IRES-puroR通过EcoRI和NotI酶切位点克隆至载体pXJ40中，得到载体pXIP-myc-K1ERNAP。

4.根据权利要求3所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：

所述的同源重组的步骤具体如下：通过引物NP868R-F和NP868R-R扩增序列如SEQ IDNO.1所示的NP868R帽状酶片段，得到片段A；通过EcoRI和BamHI双酶切，将载体切成线性片段，得到片段B；通过同源重组酶将片段A和片段B进行同源重组连接，得到重组载体A；

NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’；

NP868R-R：5’-AGAACCTCCACCTCCGGATCCATTTTTGCGCAGACAAATAAACCC-3’。

5.根据权利要求1或2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的目的蛋白为病毒蛋白，或病毒蛋白和荧光蛋白；

步骤(2)中所述的构建的方式为通过同源重组将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体；

步骤(2)中所述的K1E启动子的序列如下所示：TTACTGGACACTATAGAAG。

6.根据权利要求5所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒系统在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：

所述的病毒为鸡传染性支气管炎病毒和冠状病毒；

所述的病毒蛋白为病毒结构蛋白和病毒非结构蛋白中的至少一种；

所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白；

步骤(2)中所述的含有K1E启动子的载体还包含荧光素酶HiBiT标签序列。