[发明专利]ERβ1双荧光素酶报告基因检测系统及应用

权利要求书

1.ERβ1双荧光素酶报告基因检测系统，包括如序列1所示ERβ1编码序列克隆到空载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点上，构建出的pcDNA3.1(+)-ERβ1表达载体；以及如序列2所示ERβ1雌激素反应元件5×ERE碱基序列克隆到空载体pGL3-Enhancer的多克隆位点上，构建出的pGL3-enhancer-5×ERE荧光素酶报告载体。

2.一种雌激素受体ERβ1介导双荧光素酶报告基因检测细胞模型，其特征在于，将权利要求1所述的ERβ1介导双荧光素酶报告基因检测系统共同转染至293T细胞中，通过检测不同药物对ERβ1编码序列转录活性的影响，来筛选出与ERβ1结合的成分。

3.一种建立如权利要求2所述细胞模型的方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤1.获取目的片段：

化学合成两端添加酶切位点的ERβ1编码序列，所述ERβ1编码序列的碱基序列如序列1所示；化学合成两端添加酶切位点的雌激素反应元件5×ERE的碱基序列，5×ERE的碱基序列如序列2所示；

步骤2.构建pcDNA3.1(+)-ERβ1表达载体：

将化学合成的添加酶切位点的ERβ1编码序列和pcDNA3.1(+)进行双酶切后连接，经转化、培养和提取步骤得到重组质粒后送测序，并进行序列比对；

步骤3.构建pGL3-Enhancer-5×ERE荧光素酶报告载体

将化学合成的添加酶切位点的ERβ1雌激素反应元件5×ERE碱基序列和pGL3-Enhancer进行双酶切后连接，经转化、培养，菌液送测序；将测序正确的菌液抽提质粒。

步骤4.293T细胞培养与转染：

将293T细胞接种于24孔板，二氧化碳培养箱中培养；将pcDNA3.1(+)-ERβ1和pGL3-Enhancer-5×ERE质粒与POLO3000转染试剂混合，加入到293T细胞中，转染293T细胞。

任选地，步骤5.药物筛选的应用：

对中草药进行提取，溶解配制浓储液，将各浓储液分别作用于共转染293T细胞，用于双荧光素酶检测。

4.利用权利要求2所述的细胞模型或根据权利要求3所述方法建立的细胞模型在筛选中草药提取相中与ERβ1结合的成分应用。

5.根据权利要求4所述的细胞模型的应用，所述中草药包括大血藤、车前草、当归、连翘和茯苓。

6.大血藤提取相在制备雌激素受体ERβ1激动剂或雌激素受体ERβ1激动剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的大血藤提取相在制备雌激素受体ERβ1激动剂或雌激素受体ERβ1激动剂中的应用，其特征在于，大血藤正丁醇精提相、大血藤乙酸乙酯提取相、大血藤75％乙醇水相中的任意一种用于制备雌激素受体ERβ1激动剂。