[发明专利]一种肠道菌群保存液及制备方法

说明书

本发明提供一种易于肠道微生物采集、长途运输、保持菌群丰富度和遗传物质稳定性的肠道菌群保存液及制备方法，包括：防腐剂0.1～1％(w/v)，固定剂5～20％(w/v)，抗氧化剂1.5％(w/v)，抗凝剂100mM，缓冲液100mM，离子强度维持剂25％(w/v)，余量补足ddH₂O。有效解决了现有技术采集粪便样本DNA的保存时间短，且需要低温保存运输的缺陷，适合工业化大规模生产及应用。

技术领域

本发明应用于生物技术领域，具体涉及一种肠道菌群保存液及制备方法。

背景技术

肠道是人体消化与吸收的主要器官，其回旋盘转的结构被形象地称为人体第二大脑。而人体肠道内寄生数量繁多的微生物，包括细菌、真菌等，其中细菌占99％，大约有10万亿个，被称为肠道菌群。它们是人体内最重要的一种外环境，各种微生物按一定比例组合，相互制约，相互依存，在质和量上形成一种生态平衡。肠道菌群基因数量大约是人体基因的100倍，因此也被称为人体的“第二基因组”。肠道菌群不仅能影响人体对蛋白质、脂类、碳水化合物等营养物质的消化与吸收，还能合成多种人体生长发育必须的维生素，调节机体免疫力，抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还与肥胖、2型糖尿病、结直肠癌、炎症性肠病等数十种疾病密切相关，并且能控制人体对癌症治疗药物的反应。正常情况下，肠道各菌种与宿主相互依存、相互制约，维持一种动态平衡；一旦体内外环境发生改变(如使用药物等)，平衡状态就会被打破，导致肠道菌群失调，引发各种病症，如消化系统疾病、内分泌系统疾病、精神系统疾病、自身免疫性疾病以及一些感染性疾病。由此可见，肠道菌群对维持机体健康起着不可或缺的作用。

伴随着生物技术和基因检测科技的发展，对人类第二基因组的“肠道菌群”的关注日益增加。由于肠道微生物种类繁多，研究肠道微生物的种类构成和原始比例及其对人体的影响极其重要。16S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区(V1-V9)组成，可变区反映了物种间的差异性。采用高通量扩增子测序技术来检测微生物16S rRNA基因的特定高变区，适用于环境微生物、肠道菌群等样品的细菌和古细菌相对丰度的鉴定。16S rDNA-seq是通过提取微生物菌群的DNA，选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增，再通过高通量测序的方法，帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。利用16s技术，检测样本中的肠道微生物种类及丰度，指导受检者了解肠道微生态健康状况，评估相关疾病风险，营养合成和吸收的能力，定制个性化的健康管理方案。在医学领域，主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体间微生物的差异，研究药物或饮食干扰后菌群差异，或某一病程发展过程中肠道菌群的变化，如腹泻、肠炎、结直肠癌等。

粪菌中绝大部分为厌氧菌，其中有部分是严格厌氧菌，它们很容易在有氧环境中失去活性。传统的方法是用固体或是液体培养基对细菌进行分离培养，周期长，受技术影响难以分离培养出所有的肠道菌群，限制了人们对肠道菌群的研究。目前采用NGS高通量测序技术，不需要分离培养，通过对粪便样品进行DNA提取检测，就能全面检测人体肠道菌群种类与数量。由于微生物样本的不稳定性与样本保存的复杂性，微生物常温保存与采集是大家普遍关心的问题。因此，粪菌样本保存的相对于其他细菌的保护条件更为苛刻。