[发明专利]制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法

说明书

本发明涉及一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：构建工程菌Escherichia coli CKI‑CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶；构建工程菌Escherichia coli PPK‑UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶；构建工程菌Escherichia coli CMK‑NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶；对发酵得到的产酶细胞进行破碎，离心收集上清液得到粗酶液。本发明首次报道了具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合成，具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异源可溶性表达量和酶活力更高。

技术领域

本发明属于化合物生物技术领域，尤其是一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。

背景技术

胞二磷胆碱是生物体中卵磷脂合成的重要前体。胞二磷胆碱由日本武田药品工业公司首先开发成功，商品名称为“Nicholin””(尼可林)，现已被中国药典收录作为细胞代谢改善药。胞二磷胆碱是临床用量最大的神经激活剂，能促进卵磷脂的生物合成，恢复神经组织功能，改善脑代谢和循环，可用于急性颅脑外伤和脑手术所引起的意识障碍恢复，并可用于帕金森综合征和老年性痴呆症的辅助治疗。胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。

现有胞二磷胆碱的制备方法主要为化学合成法。通用的方法是采用cytidine-5’-phospho-morpholide和磷酸胆碱盐酸盐在乙腈或吡啶中缩合形成胞二磷胆碱。其中，cytidine-5’-phospho-morpholide可以通过CMP和吗啉在DCC中脱水缩合(Chemical andPharmaceutical Bulletin,1971,19(5):1011–1016.)或者通过选择性磷酸化胞苷(Journal of Chemical Research,2016,40(6):358–360.)的方法获得。然而，上述合成路线中使用的原料和缩合剂价格昂贵，而且需要在有毒的有机溶剂中完成反应，导致胞二磷胆碱的合成收率较低，生产成本居高不下。

近年国内大部分的生产多报道为生物转化，以各种微生物为生物催化剂，利用其中的磷酸胆碱胞苷转移酶(Cholinephosphate cytidylyltransferase，CCT，EC2.7.7.15)，以胞苷三磷酸(Cytidine triphosphate，CTP)和磷酸胆碱为底物可直接合成胞二磷胆碱，具有反应条件温和、成本低和工艺简便等特点，但也存在转化率低、产品纯度低和生产规模小等问题。詹谷宇等(中国医药工业杂志,1987,18(6):252–255.)以异常汉逊酵母的静息细胞为生物催化剂，用胞苷酸(Cytidine monophosphate，CMP)和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201210066604.7报道了用简单原料碳、氮源，在含有多微生物培养液中生物合成CMP，并累积生成胞二磷胆碱。随分子生物学技术的发展，基因工程技术成为改良产胞二磷胆碱菌株的新手段。专利201310167034.5报道利用大肠杆菌工程菌异源表达CCT酶并固定化，以磷酸胆碱和CTP为原料生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201510702581.8报道用经改造的基因工程大肠杆菌菌株作为生物催化剂，用乳清酸和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱。邓童心等(药物生物技术,2018,25(04):294–298.)通过在酵母中过表达反应关键酶CCT酶而提高胞二磷胆碱的转化率和产量，以CMP和磷酸胆碱为原料，生物转化制造胞二磷胆碱，反应7h摩尔转化率可高达73.1％。