[发明专利]ERβ介导双荧光素酶报告基因检测系统及在药物筛选的应用

说明书

本发明公开了一种ERβ介导双荧光素酶报告基因检测系统，包括如序列1所示ERβ编码序列克隆到空载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点上，构建出的pcDNA3.1(+)‑ERβ表达载体；以及如序列2所示ERβ雌激素反应元件5×ERE碱基序列克隆到空载体pGL3‑Enhancer的多克隆位点上，构建出的pGL3‑enhancer‑5×ERE荧光素酶报告载体。本发明提供的ERβ介导双荧光素酶报告基因检测的重组表达载体系统、雌激素受体ERβ介导的双荧光素酶报告基因检测细胞模型及其建立方法，不仅可以从大血藤提取相中筛选出与ERβ结合的相，确定其抑制作用或激动作用，鉴定抑制剂或激动剂，同时也适用于其他中草药的未知相筛选。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及建立一种雌激素受体ERβ介导的双荧光素酶报告基因检测细胞模型并筛选大血藤提取物中的抑制剂或激动剂。

背景技术

雌激素受体是配体调节转录因子的核受体超家族成员之一，参与雌激素反应元件或抑制某些基因的转录。雌激素受体有两种亚型，即α和β(estrogen receptorαandβ,ERαand ERβ)，这两种亚型在组织中有不同的功能和分布。目前大多数研究和观点认为女性生殖系统中以ERα为主，而心血管、神经系统、骨组织中则以ERβ占优势。雌激素对两种受体有相似的亲和力，故均能上调两种受体的表达。

ERβ广泛参与肿瘤发生、发展、浸润、转移等过程，其表达情况可能与肿瘤患者的存活情况和预后有关。消化道肿瘤中雌二醇和ERα结合会削弱ERβ的信号，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移；ERβ在非小细胞肺癌中高表达，且与细胞增殖有关。在肿瘤进展期时，ERβ高表达，则提示预后不良。ERβ抑制剂能够抑制细胞增殖，ERβ激动剂则能够促进细胞增殖。因此，选择性抑制ERβ能够更有效地达到抑制肿瘤细胞生长或者促进细胞凋亡的效果。大量研究表明，天然或人工合成的特异性配体能够激活或抑制ERβ，使其成为药物作用和功能研究的靶标。因此，寻求选择性ERβ配体抑制剂或激动剂，成为研究者努力的方向。根据临床实践，从中药中筛选可能具有植物雌激素性的成分，鉴定ERβ抑制剂或激动剂，在药物发现和临床应用中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。

大血藤是一种传统中药，别名红皮藤、大活血、红藤等，为木通科大血藤属落叶木质藤本植物大血藤的干燥藤茎、根。该植物为我国特有，为第三纪古热带植物区系的孑遗植物。大血藤含有多种类型的化学成分，例如鞣质类、黄酮类、总皂苷类、酚酸类等，并具有多种药理活性，如清热解毒、活血通经及祛风除湿等功效。在临床上，大血藤主要与其它中草药配伍，用于治疗肠痈腹痛、经闭痛经、风湿痹痛、跌打扑痛等，特别是治疗妇科疾病具有很好的疗效。因此，从大血藤中筛选ERβ的抑制剂或激动剂，对于研究其化学成分的治疗机制和发现临床药物具有重要意义。

目前，有许多报告基因检测体系可以用于细胞水平的药物筛选和理论研究，其中荧光素酶是最常用的一种。它的优点在于快速、方便，无污染，对细胞无毒性，具有很好的浓度线性范围，检测灵敏度高，半衰期短。在细胞水平的药物筛选模型除具备整体动物所具有的活细胞的结构和功能复杂性外，同时在实验上比整体动物更易于操作、易于推断实验结果，并且消耗样品量极少、特异性强。其避免了人工神经网络方法的黑箱和非选择性或低结合亲和性化合物被选择的风险，也弥补了高通量筛选法细胞模型所存在弊端，是常用的筛选方法。另外，双荧光素酶报告基因检测系统本身具有方便、灵敏和高通量的特点。但目前基于报告基因的雌激素受体ERβ抑制剂或激动剂细胞筛选模型的建立研究在国内外比较缺乏。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种ERβ介导双荧光素酶报告基因检测系统，以解决现有技术中存在的基于报告基因的雌激素受体ERβ抑制剂或激动剂细胞筛选模型缺乏的问题，筛选出有效抑制肿瘤细胞生长或者促进细胞凋亡的中药药物成分。

本发明的目的之二在于提供一种雌激素受体ERβ介导双荧光素酶报告基因检测细胞模型。

本发明的目的之三在于提供建立所述雌激素受体ERβ介导双荧光素酶报告基因检测细胞模型的方法。