[发明专利]一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法

说明书

本发明涉及一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法，包括以下步骤：(1)对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极距细胞表面距离与检测电阻上升的关系曲线；(2)提取细胞轮廓，并通过对细胞表面上5个点的无接触高度检测结果拟合细胞三维形态；(3)对电极进行三维定位，并根据细胞三维形态信息确定细胞表面上能够最大程度覆盖电极口的接触点位置；(4)控制电极移动到设定接触点处接触细胞表面，接触细胞，下降压入细胞膜并完成细胞封接。本发明所述细胞三维形态测量方法中，电极堵塞几率低，保证了后续细胞封接操作的正常进行。本发明所述的细胞封接方法可实现70％的封接成功率。

技术领域

本发明涉及细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法。

背景技术

膜片钳技术是细胞电生理信号测量的“金标准”。膜片钳操作中操作者使用内径1μm以下的玻璃电极将一小部分细胞膜吸入电极微管内，对膜中单离子通道开闭产生的PA级别的电流进行测量。在膜片钳信号记录前需要使细胞膜和电极之间形成GΩ级的封接，称为高阻封接。高阻封接是将细胞膜与周围环境进行有效的电隔离的保证，是实现高信噪比的细胞电生理信号测量的前提条件。因此提高细胞高阻封接(以下简称封接)成功率是提高膜片钳操作效率的关键。

当前的贴壁细胞封接主要由操作者手动完成，对操作者的专业水平依赖较大，贴壁封接成功率从30％到60％不等。为了提高封接成功率，应该在进行吸持前尽量增大电极口被细胞膜覆盖面积比例。由于细胞表面呈突起的形状，这就需要在细胞表面上选择合适的接触点，使得电极口与细胞表面基本处于平行状态。选择上述合适的接触点需要对细胞的三维形态信息进行检测。

现有的细胞三维形态测量方法及其缺陷：(1)原子力显微镜法：通过使用探针敲击细胞表面绘制细胞的三维形态，但是把电极安装到探针上是一项极具挑战性的工作；(2)共聚焦显微镜法：通过逐层扫描经过染色的细胞结构，堆积形成细胞三维结构，但是使用共聚焦显微镜进行细胞三维测量往往需要较长的时间，而且长时间的曝光也会导致荧光漂白等问题；(3)电极接触测量法：使用电极接触细胞表面通过图像处理检测细胞变形获得细胞高度信息，但是使用电极多次接触细胞表面很容易导致电极堵塞，继而失去进行细胞封接的能力。因此开发一种无接触的简易细胞三维形态测量方法，并利用测得细胞三维形态选择合适的接触点进行细胞封接，对于提高细胞封接成功率十分关键。

发明内容

本发明提出了一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法，该方法利用检测电极电阻值的变化趋势实现贴壁细胞表面高度的无接触测量，通过采样点处获得细胞高度拟合出整个细胞的三维形态，并根据细胞三维形态确定细胞表面上能使电极口被细胞膜以较大比例覆盖的接触点，并在此点处进行高成功率的贴壁细胞封接。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法，包括以下步骤：

S1，通过细胞轮廓检测方法获得细胞边界，并对细胞边界进行椭圆拟合，确定细胞的中心和长短轴；

S2，利用有限元模型对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极到细胞表面距离与检测电阻上升数值之间的关系曲线；

S3，在由长半轴与短半轴包裹的四分之一细胞表面上选取五个检测点，利用电极下降过程中的检测电阻值变化，进行细胞上表面五个检测点处细胞高度的无接触测量，由高度检测结果通过曲面拟合获得整个细胞的三维形态。

进一步地，步骤S3中，细胞表面选取的五个检测点中，一个为细胞椭圆中心点，两个为靠近电极一侧的椭圆长半轴起点和中心，两个为椭圆短半轴起点和中心。

进一步地，步骤S3中，五个检测点处的细胞表面高度无接触测量中，电极电阻值上升0.2％时，电极距离细胞表面的距离为1μm，各个检测点处的细胞高度值由电极的初始位置减去电极下降的距离，再减去1μm计算得到。