[发明专利]基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置

说明书

本发明公开一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置，该方法将入射激光分成三路，光束二和光束三的光偏振态相同，光束一的光偏振态与光束二、光束三的光偏振态垂直；光束先分束，后合束，并投射到样品上；光束一在样品某点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器一上形成物点的共焦像；光束二和光束三在物点上形成的三维光场分布反射后再经显微物镜、光束整形元件、扫描镜、偏振元件在探测器二上同时、并行形成物点的负共焦像；将共焦像减去附带一定权重的负共焦像即为超分辨点像，即完成一次扫描即可获得某一深度的二维图像；通过对样品不同深度进行扫描，即可建立三维超分辨图像。

技术领域

本发明涉及超分辨成像技术领域，尤其涉及一种基于偏振复用的实时三维荧光差分超分辨成像方法和装置。

背景技术

超分辨显微术是近二十年来成像与传感领域的热点课题，它为分子、细胞、纳米粒子等微观成像提供了基本工具。其目标是通过压缩成像系统的点扩散函数达到打破衍射受限分辨率的目的。高速三维超分辨显微术使得对细胞和纳米粒子的动态时空特性进行监测成为可能。人们已提出了数种近场和远场超分辨成像技术，其中远场超分辨技术包括受激辐射损耗显微术(stimulated emission depletion(STED)microscopy)、随机光学重构显微术 (stochastic optical reconstruction microscopy(STORM))、光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy(PALM))、结构光显微术(structuredillumination microscopy(SIM))等。基于深度学习的图像处理技术也能实现超分辨。

在这些技术当中，随机光学重构显微术和光激活定位显微术需要获取和处理大量原始图像才能得到一幅超分辨图像，通常要3秒钟以上。结构光显微术是一种有效的宽场超分辨显微技术，但通常也要获取9幅原始图像。受激辐射损耗显微术需要用两束波长不同的激光同时照明，而且其中一个光源是昂贵的飞秒激光器，其波长对应特定的标记蛋白的光谱性质。总的来说，这些技术还不适合低成本、快速超分辨成像与传感。

最近荧光发射差分显微术(fluorescence emission difference(FED)microscopy)被用于超分辨成像，其打破衍射受限分辨率的方法是从共焦点扩散函数中减去环状空心点扩散函数，结果是一个比共焦点扩散函数涵盖的区域更小的点像。在有的文献中，这个环状空心点扩散函数也被称为负共焦点像。相应地，通过二维横向扫描，最终图像为共焦点扩散函数图像减去环状空心点扩散函数图像。环状空心点扩散函数可以通过螺旋形位相分布的傅里叶变换实现。这一方法可以从二维延伸到三维。这时轴向的环状空心点扩散函数可以通过一个二值位相分布的傅里叶变换实现，这个二值位相元件在中心区域的位相为π弧度，其它区域为0。轴向环状空心点扩散函数与横向环状空心点扩散函数非相干叠加，产生一个三维环状空心点扩散函数。从三维共焦点扩散函数中减去这个三维环状空心点扩散函数即可实现三维超分辨。但是现有的具有二维超分辨本领的荧光差分显微术为了得到一幅二维图像，需要扫描某一深度的样品两次，分别得到样品的共焦图像和样品的基于环状空心点扩散函数图像；现有的具有三维超分辨本领的荧光差分显微术为了得到一幅二维图像，需要扫描某一深度的样品两次或三次，分别得到共焦图像和基于环状空心点扩散函数(横向与纵向) 图像(CN 106970055 A，一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置；D.Zhu，et al，Compact three-dimensional super-resolution system based onfluorescence emission difference microscopy”，Opt.Commun.405，157-163(2017))。每次扫描需要2秒以上，这对较快动态变化的样品不适用。共焦与负共焦图像之间的延迟将导致动态信息的不匹配或丢失。