[发明专利]一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明是属于临床免疫学技术领域，公开了一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用，本发明通过有效截取ApxⅣ基因的部分片段，并进行突变，获得的基因可在大肠杆菌中高效表达，同时在上清中表达。以表达纯化的rApxⅣAN作为抗原，制备了单克隆抗体，建立了猪胸膜肺炎放线杆菌间接竞争ELISA抗体检测方法，提高了特异性；该方法既可以检测及监测全部APP血清型抗体，又能区别野毒感染和现有疫苗免疫，为猪传染性胸膜肺炎疫苗的效果评价及净化提供了有力工具。

技术领域

本发明是属于临床免疫学技术领域，涉及一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用。

背景技术

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎的主要病原菌，猪只感染后能引起急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素坏死性胸膜肺炎等症状。猪传染性胸膜肺炎是一种高度接触性的呼吸道传染病，呈爆发性流行，最急性或急性型发病率和死亡率都在50％以上，是当前育肥猪和种猪死亡的主要原因之一；慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪，严重影响经济效益。而且，由于猪传染性胸膜肺炎常常与猪蓝耳病、猪圆环病等免疫抑制病产生混合感染或继发感染与流行，使得疫病变得更为复杂，临床症状加重、死亡率升高，给养猪业带来了巨大的经济损失。

疫病的精准诊断是疫病防控的重要环节。因为与猪链球菌病、辅助嗜血杆菌病等呼吸道疫病临床症状相似等原因，加上病原菌难以分离与培养，猪传染性胸膜肺炎的快速诊断一直是业界的难题。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型众多。根据荚膜多糖和脂多糖的差异，可分为15血清型。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性可分为生物Ⅰ型和生物II型，前者生长依赖NAD的菌株为生物Ⅰ型，包括血清型1～12型和15型；后者生长不依赖NAD的菌株为生物Ⅱ型，包括血清型13和14。近些年，国外有报道根据分子生物学方法，可将APP分为18种血清型。其中，APP血清型1-15型已被证实能分泌4种毒素ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV。不同血清型的APP仅产生前三种Apx毒素中的1或2种,而。ApxIV为APP种特异性毒素，所有血清型的APP都能产生ApxⅣ，且只在感染动物体内产生其中(Schaller et al.,1999)。因此建立一种基于ApxIV的通用型检测方法能，克服不同血清型间有限交叉反应的局限，实现多种血清型检测，具有潜在的理论价值和应用前景。

目前，针对猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ在检测方法方面的应用主要有PCR、乳胶凝集试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。如郝成武表达了APP的ApxIV2(1497bp-2873bp)片段，建立了乳胶凝集方法，但是敏感性欠佳，针对同一标准阳性血清LAT的敏感性为1:32倍稀释，而ELISA的敏感性为1:80以上(郝成武，2010)；杨永能合成了2对可扩增长度分别为442bp和378bp的特异引物，建立APP巢式PCR检测方法；(，2019)；黄红亮、石琴分别原核表达了apxIVA基因N端2445bp及ApxlVA3基因A端440bp，建立了间接ELISA方法，但表达产物是以包涵体的形式存在，需要变性和复性的过程。(黄红亮，2005；石琴，2007)

间接竞争ELISA与间接ELISA方法相比，提高了检测的特异性；与间接血凝IHA方法相比，提高了检测的敏感性，结果判定更加客观，还可用于大批量样品的检测。为此，构建APXIVN单克隆抗体，建立理论上可以检测所有血清型APP的间接竞争ELISA方法，为疫病诊断奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体，该单抗由杂交瘤细胞株2E6分泌得到，保藏编号为：CCTCC NO:C2020186。

本发明的另一个目的在于提供了上述单克隆抗体在制备胸膜肺炎放线杆菌血清抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：