[发明专利]检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

说明书

本发明公开检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用，所述引物组由1对外引物和1对内引物组成，所述外引物由F3和B3组成，所述内引物由FIP和BIP组成，2对引物的序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示。用该引物组建立的环介导等温扩增方法特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，可用于快速检测PCV4。

技术领域

本发明涉及医病原微生物检测技术领域，具体涉及检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物DNA病毒之一。目前可感染猪的圆环病毒包括PCV1、PCV2和2016年鉴定的PCV3。PCV1对猪无致病性，最早是1974年由德国学者从多株连续传代的PK15细胞中发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK15细胞的猪肾组织，后来进一步证实该病毒只是一种可以感染猪的常规病毒，不会对感染猪造成危害。PCV2于1998年首次报道，对猪具有致病性，在临床上主要引起仔猪多系统衰竭综合征（PDNS），肺炎，皮炎和肾病综合征以及繁殖障碍。PCV3于2016年首次在美国报道，推测其与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关，但未见具体实验证实。

2019年，科学家从我国湖南地区出现呼吸道症状、腹泻及PDNS症状的猪群中鉴定出一种新型圆环病毒——猪圆环病毒4型PCV4(porcine circovirus type 4，PCV4)。通过对PCV4全基因组和猪群其他圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）遗传进化研究发现，PCV4与猪群其他圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）处于完全不同的遗传进化分支，属于新型的猪圆环病毒（即PCV4）。目前，关于新鉴定的PCV4的致病性的研究较少，致病机理更未见研究涉及。因此，建立一种简便实用的检测方法对开展PCV4相关研究意义重大。

由于新型圆环病毒（PCV4）在2019年刚被发现，因此该病毒的相关研究还很少，目前该病毒的检测主要是采用常规的PCR技术。但是该技术存在以下缺点：1、该方法对仪器设备的要求高，对技术人员也存在较高的要求，一般猪场不具备检测的资质，需要送有资质的实验室进行检测。2、该方法也存在假阳性结果。3、检验成本高。

环介导等温扩增技术（LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是1小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物（1组外引物和1组内引物），利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，仅需简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，无需进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。目前，还未见针对PCV4的环介导等温扩增(LAMP)反应方法，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组，由1对外引物和1对内引物组成，所述外引物由F3和B3组成，所述内引物由FIP和BIP组成，2对引物的序列如下：

F3：5’-CGGAGCCATATTGAGCAGG-3’，