[发明专利]碱性蛋白酶低温突变体及其在污泥处理中的应用

说明书

本发明提供了碱性蛋白酶低温PB92的突变体SPL‑12、SPL‑17，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1‑3；相比亲本酶，SPL‑12、SPL‑17提供了改善的稳定性和低温性能，适用于碱性污泥产酸处理过程。

技术领域

本申请属于蛋白领域和环保领域，具体地，本发明提供了碱性蛋白酶PB92的低温突变体SPL-12、SPL-17，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1-3；相比亲本酶，SPL-12、SPL-17提供了改善的稳定性和低温性能，适用于碱性污泥产酸处理过程。

背景技术

污水处理的常用方法均包括将水中污染物、有机物、微生物等转移到污泥中以洁净水体的步骤，因此富含污染物、有机物、微生物的污泥的处理便成为了污水处理中的最关键和最根本的步骤，其处理成本占到污水处理成本的一半以上，也是污染排放达标的根本。

目前常用的污泥处理方式为填埋、自然干化、高温焚烧等，这些方法不仅有较高的二次污染风险，而且土地、燃料等成本也日益成为处理企业和政府的负担。为降低污泥处理的成分以及提高处理的可持续性，污泥的资源化是必然的选择，欧洲发达国家中污泥厌氧发酵处理占污泥处理总量的50％左右。

无论是以甲烷为产品的厌氧发酵还是以有机酸为产品的厌氧发酵，多需要水解以破解微生物细胞和胞外聚合物以提高厌氧发酵速率和效率，目前可用的酶包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等(Dai XH et al.Simultaneous enhancement ofmethaneproduction and methane content in biogas from waste activated sludgeand perennial ryegrass anaerobic co-digestion:the effects of pH and C/Nratio，Bioresource Technology，2016，216：323-330)。其中的蛋白酶是破坏污泥中的团聚物的主要作用酶，对破坏细胞也有作用。目前污泥处理中可使用的蛋白酶多为中性和酸性蛋白酶，对于呈碱性的污泥，如印染企业和某些有色金属冶炼加工企业的污泥以及经过碱处理的污泥效果不佳。

发明内容

为解决上述问题，申请人尝试使用了常见的PB92碱性蛋白酶处理污泥，发现蛋白溶出效果和产酸效果均不理想，推测原因是PB92的稳定性不佳造成作用时间超过2小时后酶活降低。随后申请人通过易错PCR的方法筛选PB92的稳定性变体，特别是低温稳定性改善变体，获得的SPL-12、SPL-17在此方面有明显的改善，用于污泥溶解时蛋白溶出效果和产酸量都有明显提高。

一方面，本申请提供了一种碱性丝氨酸蛋白酶变体，其在氨基酸序列为SEQ IDNO.1的碱性丝氨酸蛋白酶基础上引入了选自S76D、P129E、S130K、G260H、S130A、A166D的突变。

进一步地，所述变体的稳定性提高。

进一步地，突变为S76D、P129E、S130K和G260H组成的组，或者P129E、S130A和A166D组成的组。

进一步地，变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步地，变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

另一方面，本申请提供了上述变体在污泥处理中的应用。

进一步地，所述污泥为碱性污泥。

进一步地，所述污泥处理为发酵产酸。

进一步地，所述变体处理污泥促进蛋白和多糖的溶出。

本申请中的变体可以通过本领域公知的分子生物学和发酵工程方法生产，使用的宿主菌可以为分子生物学和发酵工程中的常用种类，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。