[发明专利]一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用

说明书

本发明提供了一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用，该提取方法包括以下步骤：(1)将贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755进行液体发酵，得到发酵液；(2)使用大孔树脂对发酵液进行提取、减压蒸馏后，得到粗提物；(3)将粗提物进行硅胶柱层析分离得到活性组分；(4)将活性组分使用半制备高效液相色谱分离纯化，得到六氢‑3‑[(4‑羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2‑α]吡嗪‑1,4‑二酮和六氢‑7‑羟基‑3‑(苯甲基)吡咯并[1,2‑α]吡嗪‑1,4‑二酮通过体外活性测试，证实了上述两种化合物具有抑制瓜列当种子萌发的作用，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

技术领域

本发明涉及应用农业微生物与生物防治技术领域，具体涉及一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用。

背景技术

瓜列当(Orabanche aegyptaica)是全寄生性高等植物，广泛地分布在地中海地区、亚洲西部和欧洲东部，对当地的农作物生产造成巨大的影响，被认为是世界范围内危害最严重的寄生性杂草。我国瓜列当主要分布于新疆、吉林、甘肃、黑龙江、河北、山东、山西、陕西、辽宁、青海、内蒙古、四川等多个省份。我国新疆是瓜列当分布和危害严重的地区，其对甜瓜、西瓜和番茄可造成半成以上的减产。由于瓜列当没有独自的根，靠独特的器官“吸盘”截流寄主的水分和营养成分维持生长，使寄主生长受到影响，给农作物产量和品质造成严重损失。轮作、施肥、深耕、土壤暴晒和人工拔除等措施在一定程度上虽能够减轻列当危害，但费工费时，效果不佳。除了耐化学除草剂的转基因作物，现有化学除草剂不能区分作物和瓜列当。由于无法有效防除瓜列当，严重影响了新疆瓜类作物和工业番茄的生产。

微生物源除草剂是利用微生物产生的代谢产物进行杂草防治的一种新型生物除草剂。通常大多数微生物如细菌、放线菌、腐生类微生物、植物病原真菌以及藻类等都含有除草活性化合物，是开发除草剂的天然宝库。近几年利用天然化合物防治瓜列当已经成为研究的热点之一。利用微生物代谢产物，以及这些代谢产物的人工模拟化合物研究开发具有高活性﹑高选择性﹑高安全性天然除草剂将会是新型除草剂发展的重要方向之一。

我们的先前研究发现贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755的发酵液具有防治瓜列当的作用，但是其发酵液中的成分很多，具体是哪一种物质成分发挥作用尚不明确。因此，有必要从贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755的发酵液提取获得活性单体物质，从而提供一种有效防治瓜列当的微生物菌株及其活性次级代谢产物。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用，通过从贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755发酵液中提取出防治瓜列当的活性物质，确定了贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755发酵液中的有效成分，得到的单体活性物质，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

本发明所采用的技术方案如下：

根据本申请的一个方面，提供了一种防治瓜列当的活性物质的提取与鉴定方法，该方法包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755进行液体发酵，得到发酵液；

(2)使用大孔树脂对发酵液进行提取，得到提取液，将所述提取液进行减压蒸馏后，得到粗提物；

(3)将所述粗提物进行硅胶柱层析色谱分离，得到活性组分；

(4)将活性组分使用半制备高效液相色谱分离纯化，得到活性物质六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(L2-11-1)和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(L2-11-2)。

进一步的，步骤(1)中，所述贝莱斯芽孢杆菌GDMCC No.60755在NB培养液中进行液体发酵，

所述发酵包括：在温度25～30℃、以转速150～200r/min下振荡培养18～36h。