[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1)细胞优化：

细胞从液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25%EDTA-胰酶进行消化，用含10%新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养15-30min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；

2)细胞传代与扩大：

将细胞用胰酶进行消化，用含9%新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成单个细胞悬液后，按1:3-1:4的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶逐级扩大，保证培养瓶的细胞密度不少于1×10⁶个/ml；

3)细胞补液：

每次传代30小时后，补充10-20%新鲜纯MEM 培养液；

4）细胞接毒：

将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒生产用毒种接入以上维持液中，继续培养至收获；

其中，所述维持液为MEM培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50IU/ml，且混合液的pH值为7.4—7.6；

5）抗原收获：

抗原一收：将带毒细胞培养18-28小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入维持液，继续培养细胞；

抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养18-24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液；

6）分装冻干

将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：细胞传代与扩大步骤中，培养瓶按照T75-T175-5L-10L进行逐级扩大。

3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：细胞传代与扩大步骤中使用的胰酶为：质量分数为0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的PBS溶液的混合液。

4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：细胞传代与扩大步骤中使用的细胞培养液为：MEM培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9%，最终混合液的pH值为7.2-7.6。

5.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：细胞接毒步骤所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒为CH-1R株。

6.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，其特征在于：细胞接毒步骤所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒接种剂量为1-3%。