[发明专利]一种高灵敏度的ECL试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提出了一种高灵敏度的ECL试剂盒，包括发光剂和氧化剂，发光剂为鲁米诺溶液，氧化剂为过氧化氢溶液，还包括增强剂，增强剂为对溴酚溶液，发光剂、氧化剂和增强剂按体积比100：100：1混合后使用，增强剂为DMSO溶解的100mM对溴酚；本发明使用对溴酚作为增强剂，对溴酚在双氧水氧化鲁米诺进行化学发光的反应过程中，大幅提高了反应过程中电子传递的效率，从而提高了单位时间的发光效率，用更少量的酶就能发出足够强度的荧光实现显影显色，实现了延长发光的平台期，并在较长时间维持较强的发光强度的目的。

技术领域

本发明涉及化学发光免疫分析技术领域，尤其涉及一种高灵敏度的ECL试剂盒及其制备方法。

背景技术

化学发光分析是一种检测微量物质的新型标记分析技术，应用于免疫学领域，主要根据化学反应产生光辐射确定抗原或抗体含量。由于其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、操作便捷、无放射危害及易自动化等优势，近年来已经成为标记免疫一个重要方向。其中以辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)为标记物的化学发光免疫分析为主要发展趋势。

鲁米诺是早期就在化学发光中广泛使用的发光物质，其化学名是3-氨基邻苯二甲酰胼，它通过被氧化产生α-羟基过氧化物的中间体，随后分解释放出光能。鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶发光体系是一种常用的化学发光分析体系，但直接用于生物大分子的测定时灵敏度偏低且容易衰减，这也是目前市面上发光底物普遍的缺陷。除此之外，还存在发光剂和氧化剂混合后，试剂稳定性差、本底高等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种检测灵敏度高，显色稳定性好，且成本低廉的高灵敏度的ECL试剂盒及其制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种高灵敏度的ECL试剂盒，包括发光剂和氧化剂，发光剂为鲁米诺溶液，氧化剂为过氧化氢溶液，还包括增强剂，增强剂为对溴酚溶液。

在以上技术方案的基础上，优选的，发光剂、氧化剂和增强剂按体积比100：100：1混合后使用。

在以上技术方案的基础上，优选的，增强剂为DMSO溶解的100mM对溴酚。

在以上技术方案的基础上，优选的，发光剂为含有0.5-10mmol/L的鲁米诺或鲁米诺衍生物和1mM EDTA的pH 8.5-9.5的缓冲液。

在以上技术方案的基础上，优选的，氧化剂为含有终浓度为0.5-10mmol/L的过氧化氢和1mM EDTA的pH为4.5-5.5的柠檬酸缓冲液。

在以上技术方案的基础上，优选的，还包括稳定剂，稳定剂添加于氧化剂内，稳定剂为0.1％的ProClin 300。

另一方面，提供了一种高灵敏度的ECL试剂盒的制备方法，包括以下步骤，

S1制备发光剂：用0.1M NaOH溶液溶解鲁米诺，然后加入到50mM Tris缓冲液中，直至鲁米诺终浓度为1mM，再加入1mM EDTA，最后用盐酸调节pH至9.5；

S2制备氧化剂：向50mM柠檬酸缓冲液中加入H₂O₂，直至H₂O₂终浓度为1mM，然后加入1mM EDTA，调节pH至5.0；

S3制备增强剂：用DMSO溶解对溴酚，直至对溴酚终浓度为100mM。

本发明的一种高灵敏度的ECL试剂盒及其制备方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明使用对溴酚作为增强剂，对溴酚在双氧水氧化鲁米诺进行化学发光的反应过程中，大幅提高了反应过程中电子传递的效率，从而提高了单位时间的发光效率，用更少量的酶就能发出足够强度的荧光实现显影显色，实现了延长发光的平台期，并在较长时间维持较强的发光强度的目的。