[发明专利]一种Taq DNA聚合酶突变体

说明书

本发明公开了一种能进行快速PCR的Taq DNA聚合酶突变体。本发明中筛选获得的突变体，在PCR和qPCR中均表现出快速PCR活性，尤其在qPCR中极低量的模板条件下也具有快速PCR的活性。基于这些优势，该突变体可以在低拷贝模板的条件下进行快速PCR，从而在临床诊断和科学研究中可以更快和更加灵敏地获得结果。

技术领域

本发明涉及生物领域，并具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种应用十分广泛的体外扩增DNA技术。PCR自1985年问世以来，逐渐扩展到各个领域。除了在实验室分子生物学中运用，在临床疾病诊断和法医鉴定上也有着十分重要的作用。比如检测基因突变和微生物或病毒感染因子等，还比如可以进一步检测抗生素耐药基因和生物威胁剂。PCR的最早的诊断用途之一是用于镰状细胞贫血的产前诊断试验。使用PCR检测镰状细胞突变比以前的方法更快速和敏感。随后进行了更多基于PCR的诊断，包括检测低拷贝数病毒靶点(如HIV)；通过检测结核分枝杆菌诊断肺结核的试验；以及用于检测胃肠道幽门螺杆菌的不同分离物。

1992年，Higuchi等人开发了实时PCR(qPCR)。这种增强的PCR方法通过荧光染料(如SYBR Green I)或荧光共振能量转移(FRET)探针实时检测反应过程中形成的产物量。有三种主要的FRET探针：5'核酸外切酶探针(TaqMan)、分子信标和FRET杂交探针。SYBR GreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时发出荧光，而当它从DNA分子释放时荧光减弱。实时PCR使得反应中DNA的起始量和整个过程中DNA的产生量实现可视化。与传统的培养方法相比，基于PCR的检测方法具有速度快、特异性强、灵敏度高等优点。

PCR反应主要依赖于DNA聚合酶。最初PCR技术中扩增DNA的酶来源于大肠杆菌聚合酶的Klenow片段。PCR扩增可以在短短几小时内就产生数十亿个拷贝的分子。随后在一些嗜热细菌中分离出了几种非常耐热的DNA聚合酶，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermusthermophilus(Tth)和Pyrococcus furiosus(Pfu)。它们在95℃的高温下依旧不会失去活性。其中，Taq DNA聚合酶是第一种应用于PCR的酶。它既有聚合酶活性又有外切酶活性。由于Taq DNA聚合酶高稳定性和高效性以及简单和经济的生产过程，这种聚合酶是大多数PCR应用中最受欢迎和最广泛使用的酶。

聚合酶链反应(PCR)的基因检测被广泛应用于疾病诊断和个性化医疗。但是，随着科学技术和社会的发展进步，临床诊断和科学研究中对于Taq DNA聚合酶的要求越来越高。这就暴露出它存在许多局限，包括DNA产量低、延伸DNA的长度短、聚合酶的速度慢、过程的保真度低和耐受性差等。

为了提高PCR的速度，科学家们已经通过调整PCR的配方和改造仪器来满足在短时间内扩增大量DNA产物的需要。目前，缩短qPCR运行时间的方法是减少变性、退火和延伸步骤的时间，或者通过将退火和延伸步骤组合的两步法来实现。虽然这样可以将运行时间缩短50％，但是当应用一系列模板引物组合时，Taq DNA聚合酶的检测灵敏度会大大降低。另外通过改变PCR的体系和减少反应体积或使用薄壁PCR管来改善传热可以进一步提高PCR的速率。然而，PCR的运行时间主要是受到PCR酶的动力学特性的限制。最具有说服力的例子就是校正家族B DNA聚合酶的加工性与PCR循环时间直接相关。另外通过融合一个双链DNA结合蛋白(Sso7d)可以将Pfu DNA聚合酶的加工性提高9倍，当扩增5kb DNA时，延伸和退火时间可以从2min缩短到30s。不幸的是，Pfu DNA聚合酶没有5’-3’的核酸外切酶活性，不能应用于一些探针检测中，而将Sso7d与Taq DNA聚合酶融合时，会使得蛋白不稳定。

因此，本领域存在对能够消除上述限制的Taq DNA聚合酶的需求。