[发明专利]一种呼吸系统疾病基因SNP位点分型优化的方法

说明书

本发明公开了一种呼吸系统疾病易感基因SNP位点分型优化的方法，包括以下步骤：1)提取DNA；2)对DNA进行PCR扩增；3)纯化PCR扩增产物；4)对纯化后的PCR扩增产物进行延伸；5)纯化延伸产物；6)上测序仪；7)分析延伸产物的荧光标记和长度信息。本发明基于SNaPshot技术，针对不同SNP位点设计不同长度的和PCR扩增引物和延伸引物来做到多个SNP在一个反应体系中进行分型，可在14个位点同时分型。由于此方法为四色荧光标记，所以可以针对各种SNP类型进行分类，同时还可以对插入、缺失进行分析。分析得到呼吸系统疾病患者的基因分型后，有助于用户的病前预防和疾病发生后医生的对症下药。

技术领域

本发明涉及基因识别技术领域，具体涉及一种呼吸系统疾病基因SNP位点分型优化的方法。

背景技术

呼吸系统疾病是我国最常见疾病，城乡居民两周患病率、两周就诊率、住院人数构成长期居第1位，所致死亡居死因顺位第1~4位，疾病负担居第3位,已成为我国最为突出的公共卫生与医疗问题之一。慢性呼吸疾病是WHO定义的“四大慢病”之一，肺癌已成为我国排名第一位的肿瘤，肺结核将成为我国排名第一的传染病，尘肺占职业病的90%，此外，新发突发呼吸道传染病等公共卫生事件构成重大社会影响。呼吸系统疾病是我国第一大系统性疾病，其发病率、患病率、死亡率、病死率和疾病负担巨大，对我国人民健康构成严重威胁。随着大气污染、庞大的吸烟人群、人口老龄化、新发和耐药致病原等问题的日益凸显，呼吸系统疾病的防治形势越发严峻。

呼吸系统疾病患者包含多种基因分型，不同基因分型对于相关药物的敏感性也不同。因此，在用药前需要了解患者的基因分型，才能利于医师对症下药。

单核苷酸多态性（SNP）标记分型的手段既有传统的手段如SSCP（single strandconformation polymorphism）和CAPs(Cleavage Amplification Polymorphisms)等，也有现在较快速的手段如MassARRAY质谱和TaqMan探针方法等，还有基于芯片的 检测手段如DNA芯片技术已经开发出来并迅速被应用和趋于成熟。使用高密度的DNA芯片或微列阵可以同时对上万个SNP的分型。目前SNP已经 广泛地应用于关联分析，基因精细定位和分子标记辅助育种过程中。但是上 述方法都存在一定的缺点：SSCP手段只能用非变性胶，实验条件苛刻，需要常温条件，一般实验室难以达到；CAPs手段实验过程繁琐，一个实验程 序需要耗费很长的时间；MassARRAY质谱和TaqMan探针方法及其他芯片方法费用相当高昂，一般实验室难以承担。

SNaPshot技术，是在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5'端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，现有技术中的采用SNaPshot（小测序）技术针对SNP 分型一般用于10~30个位点的分型，只有10个同时分型位点，且由于扩增片段长度和荧光染料种类的限制，在一个复合扩增体系中只可以同时扩增较少的SNaPshot基因座，一般为一种荧光物质标记一个基因座，一个扩增体系最多可同时复合4 个SNaPshot基因座。

发明内容

在为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种呼吸系统疾病基因SNP位点分型优化的方法，适用于与人体免疫功能紊乱/免疫功能失调相关的呼吸系统疾病，利用 SNaPshot SNP 分型技术对 14个 SNP 位点体系进行优化，针对中等通量（10~50位点）的SNP分型项目进行技术上的改进，将同时分型位点从10个提高到14个，大大提高了分型的通量的准确性，准确性能达99.99%。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种呼吸系统疾病基因SNP位点分型优化的方法，包括以下步骤：

1提取样品中的基因组DNA，得到DNA提取液；