[发明专利]恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法

说明书

本发明提供了一种恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法，为进一步研究接合转移系统提供基础。含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌，其生物保藏编号CGMCC No.20500。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法。

背景技术

萘作为多环芳烃类污染物之一广泛存在于土壤环境中，由于具有水溶性，因此极易发生扩散现象，因其具有“三致”效应(致癌、致畸、致突变)，会对人体血液健康造成一定的威胁。

目前已知的萘降解菌属种类非常多，在萘的生物降解过程中，萘降解基因大部分存在于独立染色体之外的质粒上，称为萘降解质粒，这类质粒通常能够进行接合转移完成水平基因转移。恶臭假单胞菌ND6是萘降解菌属的一种，其包含有两个巨型质粒：pND6-1和pND6-2，实现萘降解和接合转移的功能基因分别位于这两个质粒之上，其具有接合转移系统，会发生接合转移。在恶臭假单胞菌ND6的实际应用过程中，发现接合转移系统没有选择性，不仅能将ND6的萘降解能力转移给其他菌株，同时还能将ND6的其他能力转移给其他菌株，易引发基因二次污染，造成生态环境失衡，并不利于萘降解。

因此，有必要在恶臭假单胞菌ND6的基础上构建一种具有萘降解能力但又不会造成又不会造成因基因二次污染导致生态环境失衡的菌株。

发明内容

鉴于此，特提出本发明，一种含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌株及其构建方法、测定方法，本发明目的有两个，其一是提供一种具有萘降解能力但又不会造成因基因二次污染导致生态环境失衡的菌，其二是为进一步研究接合转移系统提供基础。该菌株已经于2020年08月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。CGMCC是布达佩斯条约承认的生物材料样品国际保藏单位。该菌株的编号是CGMCCNo.20500，分类命名是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

本发明的构思是：

目前，关于接合转移系统的研究主要是集中在IVB型分泌系统(T4BSS)。典型的T4BSS由30多个基因编码的蛋白组成，这些基因大多倾向于聚在一起形成基因簇。其中，偶联蛋白复合体正是组成接合转移系统的一部分，它是由dotM-dotL-dotN基因簇所编码的蛋白组成，在整个接合转移系统中充当底物识别蛋白，同时水解ATP为接合转移提供能量。由于接合转移系统不具有选择性，会造成基因二次污染，因此，从接合转移系统着手，通过抑制菌的接合转移能力，使菌株在应用时，仅表达萘降解的能力，避免基因二次污染。

为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：

恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌，其生物保藏编号CGMCCNo.20500，其dotM基因缺失第20751～21419位核苷酸。

同时，本发明还提供了上述恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1)基因的克隆与重组自杀质粒的构建

1.1)参照DNA数据库(比如：GenBank)中dotM基因序列，以ND6基因组为模板体外扩增，得到dotM基因上下游片段；

1.2)通过重叠延伸PCR技术将步骤1.1)得到的所述dotM基因上下游片段与抗性标记基因片段进行连接，得到重组片段；

1.3)将步骤1.2)得到的所述重组片段连接至携带蔗糖敏感基因(sacB)的自杀质粒上，构建缺失了第20751～21419位核苷酸的dotM基因的重组自杀质粒，即含抗性标记基因的重组自杀质粒；