[发明专利]用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及检测方法

说明书

本发明属于水产养殖中性别鉴定技术领域，公开了一种用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及检测方法，提供了3个乌苏里拟鲿雄性特异位点，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1‑3；本发明还提供从上述性别特异位点设计的多重PCR引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4‑9；本发明整合3个乌苏里拟鲿雄性特异性标记，开发了用于性别检测的多重PCR引物及其检测方法，有效排除零等位基因的干扰，能够高效、准确地实现乌苏里拟鲿的性别检测，可用于各类乌苏里拟鲿群体的性别比例与性别结构的检测与分析；本发明还公开了用于上述乌苏里拟鲿性别检测的试剂盒；本发明检测效率高，鉴定结果准，对促进乌苏里拟鲿全雄育种进程具有重要意义。

技术领域

本发明属于水产养殖中性别鉴定技术领域，具体的说是一种用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及其在乌苏里拟鲿性别鉴定中的检测方法。

背景技术

多重PCR(multiplex PCR)，是在普通PCR基础上发展出的快速、高效的PCR技术。该技术是在PCR体系中加入两对以上的引物，能同时扩增出两个以上目的片段。与普通PCR相比，该技术通过一次PCR即可达到多次PCR的效果，可有效降低检测成本，提高检测效率。在生物的群体遗传多样性分析、物种鉴定、亲子鉴定、疾病诊断、性别检测等众多研究领域中广泛应用。

乌苏里拟鲿(Pseudobagrus ussuriensis)是分布于我国黑龙江至珠江水系的鲿科鱼类。由于味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，同时其养殖技术难度不大、养殖病害少，养殖范围也在不断扩大，目前已在全国十余个省份开展养殖。乌苏里拟鲿雄性生长优势十分明显，在二龄时可达雌性的3倍以上，因此，具有极大的全雄育种潜力。

在全雄育种中对目标个体进行快速、准确的性别鉴定尤为重要。虽然雌、雄个体可通过形态鉴别，然而这仅限于生理性别的鉴定。在育种工作中，往往需要用雌或雄激素对目标群体进行性逆转处理，对于性逆转个体的遗传性别则无法通过形态特征来鉴定。此外，在一龄以前，雌、雄个体的形态特征很不明显，无法通过形态鉴定性别。因此，研发性别特异性分子标记是对乌苏里拟鲿进行快速、准确性别鉴定的有效途径。我们曾基于AFLP技术(Amplified Fragment Length Polymorphism)开发出1个雄性特异性SCAR标记(SequenceCharacterized Amplified Regions)(Pan ZJ,Li XY,Zhou FJ,Qiang XG,GuiJF.Identification of Sex-Specific Markers Reveals Male Heterogametic SexDetermination in Pseudobagrus ussuriensis.Marine Biotechnology,2015,17(4):441-451.)，以及1个雄性特异微卫星标记(授权公告号：CN106811540B)。然而，在实际应用中，我们发现这两个标记均存在一定缺陷：由于SCAR标记是通过判断某个个体在相应位点是否有扩增条带来鉴定性别，如果某一个体在引物所在的侧翼序列发生点突变，造成该个体中无扩增条带，即出现了零等位基因(Null Allele)，那么利用该标记对这类个体的性别判断就可能出现错误；微卫星标记是通过某个体扩增条带是一条还是两条来鉴定性别，而如果某个个体在微卫星标记引物所在位置出现零等位基因，则微卫星标记在这个个体中将无扩增条带，从而无法对该个体进行性别鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及检测方法，即提供一组乌苏里拟鲿性别特异性的多重PCR引物，作为精确、高效检测乌苏里拟鲿性别的有利工具，可以有效解决背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及检测方法，多重PCR引物所在核苷酸序列为SEQ ID NO:1-3。

一组能特异性扩增如SEQ ID NO:1-3中至少一条序列的引物组。