[发明专利]一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法

权利要求书

1.一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制：

精密称量5-氨基酮戊酸的标准物质，用极性溶剂稀释配制成6-8个浓度梯度的标准曲线和4-5个浓度水平的质控样品工作溶液；将5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液按比例与替代基质混合，涡旋仪涡旋配制得到替代基质标准曲线样品；所述替代基质为不含有5-氨基酮戊酸标准物质；将5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液按比例添加到真实空白基质中，涡旋仪混匀得到真实基质质控样品；低于真实空白基质中本底浓度的质控样品，由替代基质中加入质控工作溶液制备得到；其中，5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液与替代基质混合的体积比大于或等于1∶20；5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液与真实空白基质的体积比大于或等于1∶20；

(2)稳定性同位素内标工作溶液配制：

精密称量稳定性同位素标记的5-氨基酮戊酸标准物质，稀释配制成单一浓度的内标工作溶液；

(3)样品除蛋白和衍生化处理：

分别取混合好的标准曲线样品、真实基质质控样品、低于真实空白基质中本底浓度的质控样品、真实空白基质样品、未知浓度待测样品到容器中，加入步骤(2)制备的稳定性同位素内标工作溶液，涡旋混匀；对所有样品加入有机试剂，振摇后高速离心，取上清液用氮气吹干；每个样品中加入衍生化试剂，涡旋反应后离心，得待测样品；所述有机试剂为甲醇，所述衍生化试剂为正丁醇；

(4)高效液相串联质谱分离检测：

用高效液相色谱系统对步骤(3)制备的样品进行分离，用质谱进行检测；其中，高效液相串联质谱分离检测，其中色谱条件：色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18Column，3.5μm，2.1mm x 100mm；流动相组成：流动相A：含有0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含有0.1％甲酸的甲醇溶液；质谱条件：待测物和内标的离子对分别是，188.1/114.1和191.1/55.1；喷雾电压：5500v；离子源温度：500℃；加热辅助气：50psi；

(5)方法标准曲线建立和准确性确证：

将步骤(4)采集的数据，用替代基质中5-氨基酮戊酸的浓度，与在高效液相色谱串联质谱上对应仪器响应进行拟合，所述对应仪器响应为5-氨基酮戊酸和内标峰面积比值，建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线；根据真实空白基质样品和质控样品的仪器响应，代入标准曲线中回算浓度，并评价方法的准确度；

(6)检测未知样品浓度：

将未知浓度待测样品的仪器响应值代入步骤(5)建立的标准曲线公式中，计算出未知浓度待测样品中5-氨基酮戊酸的浓度。

2.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制，所述替代基质能模拟生物基质的溶液，用替代基质制备标准曲线；所述真实空白基质为生物液体基质，以及粪便和组织器官匀浆液，用真实空白基质制备质控样品，质控样品的浓度为添加的5-氨基酮戊酸与基质中本底浓度之和。

3.如权利要求2所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述生物液体基质为生物来源的全血或血清或血浆或尿液。

4.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中极性溶剂为水。

5.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中样品除蛋白和衍生化处理，所有样品加入有机试剂除去样品中的蛋白质，所得到的上清液吹干后与衍生化试剂进行反应，得到极性变小的衍生化合物。

6.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中高效液相串联质谱分离检测，所使用的液相系统为反相液相体系，质谱为三重四极杆质谱检测器。