[发明专利]一种从湘西酸肉中分离筛选芽孢杆菌的方法

说明书

本发明提供了一种从湘西酸肉中分离筛选芽孢杆菌的方法，以湘西酸肉为主要实验材料，采用一般培养和平板划线分离方法分离筛选出可高效降解且耐受亚硝酸盐的纯化芽孢杆菌；从湘西酸肉中筛选出的这株芽孢杆菌有较强的高亚硝酸盐降解和耐受能力，目的是将其开发成肉类专用发酵剂，提高发酵肉制品的营养安全性与传统酸肉产业化生产，为开发直投式肉用发酵剂提供优质菌种资源，也为低亚硝发酵肉制品生产带来更大的便利和增值空间，为发酵肉制品的发展提供了广阔前景。

技术领域：

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种从湘西酸肉中分离筛选芽孢杆菌的方法。

背景技术：

酸肉是一类有着悠久历史的发酵肉制品；湘西酸肉是由猪肉、食盐和糯米在一定条件下经微生物长期发酵及其酶法发酵作用而成的，发生了复杂而深刻的化学变化，所以可开坛即食，食之鲜嫩。少数民族地区特色性的酸肉为发酵类肉制品，流行于苗族、侗族、布依族等地，有“吃不离酸”和“三天不吃酸，走路打乱窜”的俗语；由于酸肉营养丰富、风味独特和保质期长而成为许多少数民族喜爱的一类发酵肉制品；硝酸盐和亚硝酸盐是经常使用到的两种食品添加剂，硝酸盐在微生物还原酶的作用下可变成为亚硝酸盐，而亚硝酸盐容易使肉类蛋白质分解，生成亚硝胺等强致癌物；在发酵肉制品的生产中为确保肉制品的质量安全，食品添加剂使用标准(GB 2760-2014)明确规定，肉制品的亚硝酸盐添加含量应≤0.15g/kg，残留含量应≤0.03g/kg；肉制品的硝酸盐添加含量应≤0.5g/kg，残留含量应≤0.03g/kg，实际上，即使生产中亚硝酸盐添加量符合国家标准，肉制品中的亚硝酸盐残留量仍会出现大量超标现象，可能的影响因素有温度、腌制时间、原材料新鲜程度和肥瘦比例等。

酸肉中富含酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等微生物，这些微生物是筛选肉用发酵剂菌株的重要生物资源，具有很大的开发潜力；正是由于这一种巨大的市场开发潜力，探究出酸肉制品的发酵菌种与其理化成分自身转变特性之间的相关性，揭示出传统酸肉中微生物与其产品质量之间的内在联系，是酸肉发酵体系中营养成分的转变与微生物的优势有益菌种进行研究和分析的有必要性；革兰氏阳性菌芽孢杆菌是一类能产生抗力内生孢子的细菌，细胞呈杆状，具圆端或方端，常以成对或链状排列；芽孢杆菌在自然界中分布十分广泛，存在于水、土壤、空气以及动物肠道等处，甚至更恶劣的环境中都有存在；与其他微生物活菌制剂相比，芽孢杆菌在恶劣的环境下能形成芽孢(内生孢子)将自己保护起来，在条件适宜时又可以重新萌发成营养体，它们对外界有害因子抵抗力强，具有复活率高、耐酸碱、耐高温高压、快速复活和较强分泌酶等特点，在有氧和无氧条件下都能存活，因而在环保、农业和工业生产、食品加工和保鲜等方面具有较高的应用，目前为了减少亚硝酸盐在发酵肉制品中的残留，通常采用的是加入抗坏血酸等添加剂的化学方法与加入乳酸菌等有益菌种的生物方法，但是从湘西酸肉中分离筛选出可高效降解和耐受亚硝酸盐的芽孢杆菌作为发酵剂的研究则较少。

发明内容：

本发明的目的在于改进传统酸肉发酵工艺和构建及筛选优良性状的有益微生物菌种，提高发酵肉制品的营养安全性与传统酸肉产业化生产，提供一种从湘西酸肉中分离筛选出具备高亚硝酸盐降解和耐受能力的芽孢杆菌的方法。

本发明采用如下技术方案实现其发明目的：一种从湘西酸肉中分离筛选芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：

步骤一：原料处理：在装有90mL无菌水的三角瓶内加入10g剪碎后的湘西酸肉，之后做10倍系列稀释，每个稀释度取0.1mL加到牛肉膏培养基上，适当温度下培养48h得到菌株；

步骤二：菌株的分离纯化：对步骤一得到的菌株进行革兰氏镜检，观察菌株形态，挑选出典型菌株，并经过平板反复划线或的菌落，经过分离纯化后得到纯的目的菌株；

步骤三：菌株的初步筛选：将步骤二中得到的纯的目的菌株接种于牛肉膏培养基中，放入恒温培养箱中培养18h，取10％体积分数的新鲜菌液接种于含有一定浓度的牛肉膏培养基中，并加入2ml对氨基苯磺酸溶液混匀，避光静置5min，加入1ml盐酸萘乙二胺溶液混匀，光静置15min，挑选颜色较浅的菌株；