[发明专利]一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用

说明书

本发明提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用。所述评价方法中，将携带荧光标记A的靶细胞与自然杀伤细胞共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记，而后分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像，再通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述自然杀伤细胞的免疫活性。本发明中采用由图像直接得到检测结果的“直读法”，检测结果更加准确直观，适用于标准化要求较高的医疗诊断和生物医药产业化等领域。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，涉及一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用。

背景技术

体外自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)的免疫活性评价对肿瘤、血液病、感染性疾病、免疫性疾病、器官移植等病因的分析、治疗监控、预后情况及转归等方面都有重要的指导意义。NK细胞主要存在于外周血、脾脏和骨髓中，淋巴结中含量极少。其不同于T细胞和B细胞，对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加，也不需抗原预先致敏，即可对多种肿瘤细胞或感染细胞有迅速杀伤和溶解作用。

NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。因其与多种疾病的发生、发展及治疗转归密切相关，所以NK细胞的杀伤效力可以较大程度地反映机体的细胞免疫功能。

研究表明，多数肿瘤患者特别是中晚期及伴有转移的癌症患者，淋巴细胞的自然杀伤细胞活性往往降低，并随着肿瘤的发展进一步下降。癌症患者手术后，如果NK细胞活性继续低下，预示着肿瘤呈进行性生长或转移，相反如果NK活性恢复正常，预示治疗有效且预后良好。此外，白血病患者、器官移植患者、习惯性流产患者生理机能的相应变化，都能在NK细胞活性指标上得到明显体现。因此，这一指标对诊治多种疾病以及判断预后都有很大帮助。

常用的NK细胞杀伤检测方法包括：51Cr释放试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Calcein释放实验等。其中经典的方法是51Cr释放实验，该方法可重复性好，但是因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。

但是目前，用于检测NK细胞杀伤效力的方法都是通过释放物质的量来间接测定的，即先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的NK细胞进行共孵育，当靶细胞受到NK细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上清中，通过测定释放物质的含量可以测定NK细胞的活性。这些方法不能直接反应细胞的变化，且反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。例如，CN104928243A公开了一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增及活性检测方法。其中，NK细胞活性检测方法中使用荧光标记CFSE标记靶细胞，效靶细胞共培养后再使用流式细胞仪分析细胞杀伤率，该方法可以在单个细胞水平检测细胞的杀伤功能，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应用前基础研究方面具有重要意义。但是，流式细胞术存在一定的缺陷，其检测过程受操作人和分析人的主观误差影响较大，且检测结果不直观，无法直接重复验证检测结果的准确性，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证。

因此，本领域亟需提供一种基于显微图像识别、直观可视并且准确的评估方法来评价NK细胞等免疫细胞的杀伤活性。

发明内容