[发明专利]低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置

说明书

本发明公开了低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置，将上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元，上层水相离心单元的下部设有微米管，在离心力的作用下，上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴，通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。所述的油相中可添加有互溶激光诱导固化剂，诱导源的作用下使油相快速交联固化；应用于核酸等温扩增，实现数字化核酸扩增。本发明可生成大小均一、高质量油包水液滴。微升级的水相溶液在几分钟内即可快速产生高通量的油包水液滴，与核酸的等温扩增结合，同时可借助固化平台实现液滴的超快固化。

技术领域

本发明属于分析传感领域，主要涉及低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置，可用于单分子核酸检测等。

背景技术

近年来，数字化核酸检测技术在生物检测、化学传感、医疗诊断等领域发挥具有巨大的作用。作为第三代核酸扩增方法，通过利用微液滴的技术理念将样品分配到上千万个单位中，以此将样品稀释至单分子水平。每个液滴中含有核酸或者不含核酸，经过扩增后，含有核酸的液滴有荧光信号，荧光液滴在数量上符合泊松分布。通过计数统计，可实现目标核酸等的样品的绝对定量检测。

如何有效的产生高通量、大小均一、稳定的液滴将影响最终检测的精度和灵敏性。常规的微流体技术可以产生单分散的液滴，但需要专门的仪器例如注射泵以及定制的微纳加工芯片。近年来研究的液滴发生装置中，CN109536590A提出一种基于微孔芯片的单细胞基因检测方法，但是这种多层芯片的制作繁琐，加工工序复杂。CN110841734A提出一种单泵液滴生成系统，然而注射泵引入会混合污染的风险。

此外液滴在连续油相中，在热力学上存在聚集的趋势，在PCR热循环更易出现膨胀和收缩的情况不利于实现实验的高精度，现有的解决办法有通过在油组分里添加表面活性剂如ABIL EM90，在液滴增添乳化剂以抵制液滴间的聚集碰撞局部缓解了液滴膨胀的问题。2018年和2020年牟颖课题组分别提出一种热固化和紫外光固化的方案，并有效缓解液滴膨胀的问题，但是亦存在固化时间过长的问题。

综上所述，目前公开的可用于核酸检测的液滴型数字化PCR存在以下几点问题：

1）液滴生成装置结构一般比较复杂，不易大规模推广；

2）微流芯片中泵引入了外部污染的风险；

3）液滴在加热或紫外光照过程中可能存在流动，团聚，或固化时间过长的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提出低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置。

一种低成本广适应离心式数字液滴发生方法，将上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元，上层水相离心单元的下部设有微米管，在离心力的作用下，上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴，通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。

所述的油相中添加有互溶激光诱导固化剂，诱导源的作用下使油相快速交联固化；应用于核酸等温扩增，实现数字化核酸扩增。

所述的油包水液滴平铺在玻片上，玻片放置在三维步进位移平台上，飞秒激光器出射的超快激光经过透镜组进行准直， 并通过SLM 投影模块出射衍射光斑或者图案，SLM投影模块位于位移平台下面，由控制器控制，光束再通过倒置显微和聚焦系统汇聚使其达到油相固化的阈值能量并缩小光斑，最终入射到油相内特定的位置，油相由于固化剂组分的多光子吸收聚合作用可瞬间固化，三维步进位移平台依次从平行方向和垂直方向扫描控制聚焦点的位置，逐层扫描平面上液滴的外部油相，最终实现液滴的快速固定。

一种采用所述的方法的装置，包括上层水相离心单元和下层油相离心单元，上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元，上层水相离心单元的下部设有微米管，在离心力的作用下，上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴，进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴，通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。