[发明专利]一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用

说明书

本发明提供了一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用，属于免疫细胞治疗领域。所述慢病毒冻存液的配方包括：人血浆白蛋白(HSA)注射液，0.9％生理盐水注射液；其中所述HAS的浓度包括10％，20％，30％，40％。

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗领域，具体地，涉及一种嵌合抗原受体(CAR-T)慢病毒冻存液及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor modified T cells，CART)是通过基因修饰的手段，将一个人工合成的CAR分子(Chimeric Antigen Receptor)表达在T细胞膜上，使T细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。CAR分子包括胞外的结合区域(能特异性识别靶抗原的单克隆抗体来源的单链抗体(scFv))、铰链区、跨膜区和胞内的信号段。这一技术有几个优势，例如，CAR蛋白对肿瘤表面的TAA(肿瘤相关抗原，tumorassociated antigen)的识别是以一种MHC(major histocompatibility complex)-非依赖性的方式进行的，因而CART细胞可以克服肿瘤细胞通过下调MHC分子逃脱免疫攻击，并且CAR识别没有MHC限制性，同一种CAR可以应用于不同的患者。另外，CAR蛋白可以识别细胞表面的任何类型的抗原，包括蛋白、糖类、糖脂，这样，相对于TCR只能识别MHC-肽段，CAR使T细胞能识别的肿瘤表面标志物的范围大大增加。

目前CAR-T治疗主要是采取的携带有特异性针对肿瘤抗原的的CAR的慢病毒作为基因投递的载体，但是目前的一个瓶颈是，通过超离浓缩或者浓缩纯化后的慢病毒，用PBS或者生理盐水复溶后，新鲜慢病毒的感染T细胞的效率很高，但是慢病毒置于-80度保存，冻融后的慢病毒的感染效率约损失40％-60％，在CAR-T治疗产业中，急需一种高效、符合药典的慢病毒冻存液，相应的，本发明所述冻存液不局限于CAR-T治疗，可用于所有使用慢病毒作为基因治疗手段的生物技术。

本发明以目前国内外技术成熟的CD19 CAR-T为例，验证所开发的慢病毒冻存液对慢病毒颗粒的保护效率，其中CD19 scFv采用经典的FMC63抗体，通过筛选不同浓度的HSA对慢病毒冻融后感染效率的比较，最终确定了最佳有效浓度成分为30-40％，为CAR-T治疗的产业化发展提供符合IND，NDA需要的慢病毒冻存液。

发明内容

本发明旨在解决目前基因治疗中，作为基因投递的载体-慢病毒在低温保存中不稳定，冻融后感染效率明显下降，导致治疗效果不稳定甚至失败的问题，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒冻存液的配方，包括如下体积分数的组分：10-40％人血浆白蛋白(HSA)，60-90％生理盐水注射液。

第二方面，本发明提供了一种优化慢病毒冻存液配方的方法，配方成份单一，方法简单易操作，效果显著，制备成本较低，易于产业化生产。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的慢病毒冻存液在制备CART细胞中的用途。

第四方面，本发明提供了一种如上所述的慢病毒冻存液在制备CART细胞用于治疗肿瘤的药物中的用途。

第五方面，本发明提供的慢病毒冻存液的配方不仅限于CAR-T治疗方法，也可用于所有基于慢病毒的基因治疗方法。

本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，可通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1为cryoS001-20％与两款商业化慢病毒冻存液三次冻融后的比较

图2为.cryoS001-20％与两款商业化慢病毒冻存液三次冻融后CAR阳性率的比较

图3为四种不同浓度的慢病毒冻存液三次冻融后流式检测的比较

图4为四种不同浓度冻存液配方的慢病毒三次冻融的感染效率比较