[发明专利]一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞分离技术，旨在提供一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法。包括主要步骤：分离肝脏内胆管；沉降与多步离心富集导管干细胞；消化成单个细胞。本发明通过胆管片段的重力沉降和多步骤离心，分离得到较纯的胆管细胞。本发明能够提高细胞得率和细胞活率。与显微镜下手工挑选胆管细胞相比，由于减少了手工操作步骤，能够减轻操作者的工作负担；与流式细胞分选术相比，由于不需要孵育流式抗体和使用流式分析仪，因此能够降低经济成本。

发明领域

本发明涉及细胞分离技术，特别涉及一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法。

背景技术

胆管细胞是位于肝内和肝外胆管内的上皮细胞，具有增殖性，参与胆汁的产生和体内稳态。胆管细胞与肝细胞损害、肝脏再生密切相关，故原代胆管细胞在体外的分离和培养，是肝脏疾病体外研究的基础。在现有技术中，胆管细胞的分离方式主要有显微镜下手工挑选和流式细胞分选法两种。前者的挑选过程对无菌条件要求较高，且耗费精力；后者经济成本较高，获得的胆管细胞的活率容易受到影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种高效分离小鼠肝脏胆管细胞的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种高效的分离小鼠肝脏胆管细胞的方法，包括以下步骤：

(一)分离肝脏内胆管：

(1)取新鲜小鼠尸体，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部，经下腔静脉注射无菌PBS 1×灌肝去除红细胞；切下整个肝脏，在装有无菌PBS1×的培养皿中清洗后，置于含预冷改良DMEM培养基的培养皿中备用；

所述改良DMEM培养基是指，包含1％体积比的100×谷氨酰胺、110mg/L的丙酮酸盐、1％体积比的FBS和1％体积比的青霉素/链霉素的DMEM培养基；

(2)将肝脏剪切成1mm³左右的碎片，然后转移到50ml离心管中；

(3)加入15毫升预冷清洗液，用10毫升移液管上下吹打，去除漂浮在溶液上部的红细胞和脂肪；待肝脏组织碎片沉到管底，尽量弃去上清液，包括任何漂浮的脂肪块；按本步骤重复洗涤一次；

(4)用100μl微量移液枪除去残留的清洗液，加入10毫升37℃预热的消化液；将混合液移至振荡器中，在37℃条件下震荡处理45～90分钟；

(5)将混合液在37℃条件下震荡50-60分钟时，混匀后用微量移液枪吸取200ul，在显微镜4倍目镜下下检查等分试样是否存在大于3个的多个细胞聚集的胆管细胞团；如果不存在，则将混合液再返回振荡器，在37℃下继续震荡处理；每20分钟检查一次等分试样，直至胆管细胞团出现；

(6)将混合液的上清移至50ml离心管中，加入等量预冷洗涤液，在250G和4℃条件下离心5分钟；弃上清，加入预冷洗液至15ml，混匀后再次离心，去除剩余的消化液，得到细胞团；

(二)沉降与多步离心富集导管干细胞：

(7)将细胞团重悬于含10ml清洗液的50ml离心管中，然后垂直置于冰上；静置30分钟后去除上清，留下沉淀；

(8)向沉淀中加10ml清洗液，经筛网过滤至另一个50ml离心管中；用无菌镊子夹除组织块，用移液枪吸取1ml清洗液轻柔冲洗筛网，将筛网上的白色细胞团收集至过滤后的滤液中；将滤液在60G和4℃条件下离心1min；

(9)去上清后，沉淀加5ml预冷清洗液混匀，在60G和4℃离心条件下1min；

(10)去上清，沉淀加1ml预冷清洗液混匀，转移到1.5ml离心管内，在500rpm 和4℃条件下离心1min；

(三)消化成单个细胞：