[发明专利]一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法

说明书

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法。本发明中，本发明所述的检测PⅢNP的抗体是根据PⅢNP的结构特点，特异设计的抗原多肽序列，作为抗原免疫BALB/c小鼠，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株5E8‑3，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1阳性。所述抗PⅢNP单克隆抗体杂交瘤细胞株5E8‑3，其能够稳定分泌高效价的抗Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)的单克隆抗体。用本发明提供的Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)抗体研制的免疫试剂可以精确地测定血清样本中的Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)，能够反应出Ⅲ型胶原合成与降解的程度，具有高灵敏度、准确性，用其制备的检测试剂与市场上在售进口试剂检测结果具有高度相关性，可以代替进口抗体。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体为一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法。

背景技术

肝纤维化是肝硬化的早期阶段，是慢性肝病的共同病理学基础。目前，诊断肝纤维化最可靠的方法是肝活检；但由于肝穿刺存在取样误差，且患者不易接受，在实际应用中有一定的局限性。随着肝纤维化研究的逐步深入，肝纤维化的血清学诊断能够为判断病情、估计预后及评价抗肝纤维化药物疗效提供一定的科研价值和临床意义。通常所说的肝纤四项即最为常用的肝纤维化血清学指标，包括Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)。PⅢNP在肝纤维化时出现最早，适合于肝纤维化的早期诊断。

PⅢNP是由Ⅲ型前胶原转化而来，Ⅲ型前胶原被分泌到细胞外之后,氨基端和羧基端前肽序列(propeptide)被专一的蛋白水解酶切除,前胶原转变成了胶原分子，其中氨基端的前肽序列就形成了PⅢNP并释放入血。它的产生有两种情况：一是在Ⅲ型胶原合成晚期，从Ⅲ型前胶原水解而来；二是,成熟的胶原纤维表面仍有Ⅲ型前胶原分子,在胶原纤维降解的过程中,也被水解下来。因此，PⅢNP的含量反应了Ⅲ型胶原合成和降解的水平。由于Ⅲ型胶原主要存在于肝脏，因此血清PⅢNP的含量可反应肝纤维化的程度和肝病的活动性。正常人群血清中的PⅢNP含量15ng/mL。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法。

本发明采用的技术方案如下：一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法，其特征在于：所述杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法包括以下步骤：

S1:单抗5E8-3的制备,PⅢNP抗原多肽的设计、制备及表达，根据GenBank上的人Ⅲ型前胶原基因COL3A1基因以及其相对应的蛋白序列(登录号：NM_000090.4，NP_000081.2)，并根据文献报导的其结构特征，精确的找到该基因蛋白水解酶酶切位点之前的前肽序列，即PⅢNP的序列，并考虑免疫源性分析，亲疏水性及表面可及性分析，

S2:免疫小鼠，将PⅢNP抗原多肽与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg；

S3:免疫血清效价测定，采用间接ELISA法测定免疫血清效价；取50μg PⅢNP抗原多肽溶解于10ml 0.05M pH9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜；

S4:第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA10mM PBS进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃30min；

S5:同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2M H2SO4终止反应，测450nm吸收值；