[发明专利]一种干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因筛选的方法

说明书

本发明涉及一种干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因筛选的方法，步骤如下：培养野生型、转染干扰MSTN和对照的牛骨骼肌卫星细胞，提取RNA并反转录；选择若干候选内参基因，进行荧光定量PCR反应，制作标准曲线；判断引物扩增效率的高低，以及模板浓度与Ct值之间的线性关系；对候选内参基因的表达稳定性进行分析，将表达稳定性最优的候选内参基因作为筛选出的内参基因。本方法为干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞的基因表达研究筛选出合适的内参基因，为干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞基因表达的荧光定量PCR检测的准确性提供有力保障，可为今后牛骨骼肌卫星细胞不同处理、不同时期中基因的表达分析提供参考。

技术领域

本发明属于生物、细胞、组织工程技术领域，尤其是一种干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因筛选的方法。

背景技术

肌肉的发育和形成需要经历一个复杂的多级过程，这与多种因素作用有关，特别是受到与肌肉发育相关基因的调节。有文献报道，影响肌肉发育的基因主要起正向促进和反向抑制两种调控作用，且作用机制十分复杂。影响肌肉发育的基因表达调控细胞的结构和功能，从而进一步影响肌肉的生长发育，而肌肉发育程度是养殖业获得利润大小的最直观的衡量标准。因此研究肌肉发育过程中关键基因的表达变化对理解肌肉发育分化调控机制有重要意义。

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技术作为研究基因表达分析的常用方法，其具备高通量、特异性强、重复性好和灵敏度高等优点。为了减小试验中材料因素或人为因素对结果所造成的误差，常选用内参基因对目的基因进行校正，理想的内参基因在不同组织或不同类型细胞中的表达无明显差异，且不受试验和各种因素的影响。但大量研究表明，在不同试验材料及不同时期基因表达研究中各内参基因的表达稳定性有所不同，如果盲目选择内参基因，可能导致基因表达结果不精确，甚至可能获得错误的结论。目前，常用内参基因在肌肉组织研究中受到肌肉发育相关基因的影响，肌肉生长抑制素Myoststin(MSTN)是一种重要的肌肉生长发育负调控因子，因此在采用实时荧光定量PCR对牛骨骼肌卫星细胞中MSTN基因表达进行分析时，选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因筛选的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种干扰MSTN牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因筛选的方法，步骤如下：

培养野生型、转染干扰MSTN和对照的牛骨骼肌卫星细胞，提取RNA并反转录；

选择若干候选内参基因，进行荧光定量PCR反应，制作标准曲线；

根据标准曲线、扩增效率和决定系数，判断引物扩增效率的高低，以及模板浓度与Ct值之间的线性关系；

对候选内参基因的表达稳定性进行分析，将表达稳定性最优的候选内参基因作为筛选出的内参基因。

而且，所述候选内参基因包括HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ。

而且，采用geNorm、Normfinder和Bestkeeper程序分别对候选内参基因的表达稳定性进行分析。

而且，采用geNorm程序对候选内参基因的表达稳定性进行分析时，步骤如下：

导入QPCR所获得的Ct值；

通过计算候选内参基因表达稳定度的平均值M，判定各候选内参基因的表达稳定性；