[发明专利]一种适用于蛹虫草菌培养的含有还原型谷胱甘肽的合成培养基、制备方法及应用

权利要求书

1.含有还原型谷胱甘肽的合成培养基在蛹虫草菌发酵生产虫草素中的应用，其特征在于，采用合成培养基与还原型谷胱甘肽制备含有还原型谷胱甘肽的合成培养基，还原型谷胱甘肽添加量为1.0~3.0 g/L，该合成培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁；

具体包括：20-50 g/L葡萄糖、5-10 g/L硫酸铵、0.5-1 g/L磷酸氢二钾、0.5-1 g/L磷酸二氢钾、0.5-10 g/L硫酸镁、0.5-15 g/L硫酸锌、5-10 g/L甘氨酸、0.5-1 g/L天门冬氨酸、0.5-2 g/L谷氨酰胺、0.1-0.5 g/L酪氨酸、0.05-0.2 g/L半胱氨酸、0.5-1 g/L亮氨酸、0.5-2 g/L赖氨酸、0.05-0.5 g/L苯丙氨酸、0.1-1 g/L维生素B₁。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，合成培养基制备方法为：

（1） 将葡萄糖溶解于1份水中，作为组分A，单独装于三角瓶内，121 ℃条件灭菌15-20min；

（2）将无机盐硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁及硫酸锌溶解于4份水，作为组分B，单独装于三角瓶内，121 ℃条件灭菌15-20 min；

（3）将维生素B₁、甘氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸溶解于5份水，作为组分C，单独装于三角瓶内，利用无菌滤膜过滤除菌，或121 ℃条件高温灭菌15-20 min；

（4）将组分A、B和C按1：4：5体积比混合，配制成合成培养基；

（5）称取还原型谷胱甘肽溶于去离子水，每1000 mL去离子水称取300 g还原型谷胱甘肽，利用无菌滤膜过滤除菌，添加至合成培养基中，制备含还原型谷胱甘肽的合成培养基。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在蛹虫草菌培养初期或中后期向合成培养基中添加还原型谷胱甘肽。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以蛹虫草菌为生产菌株，将其按1%（v/v）接种量接种至含有还原型谷胱甘肽的液体合成培养基中，自然pH，25 ℃，160 r/min下培养15~25 d，还原型谷胱甘肽添加量为1.0~3.0 g/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

①菌种活化：从4℃冷藏的蛹虫草菌试管斜面接种菌丝到固体培养基中，25 ℃静置培养2周至产生孢子；

② 孢子悬液的制备：用0.9% NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③ 液体培养：配制由组分A、B、C组成的合成培养基，向其中添加终浓度为1.0~3.0 g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，终浓度控制在10⁵~10⁶孢子/mL，25 ℃，160rpm下培养15-25 d。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

①菌种活化：从4℃冷藏的蛹虫草菌试管斜面接种菌丝到固体培养基中，25 ℃静置培养2周至产生孢子；

②孢子悬液的制备：用0.9% (w/v) NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③固体培养：配制由组分A、B、C及2% (w/v)琼脂组成的固体合成培养基，向固体合成培养基中添加1.0~3.0 g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，每100 mL固体合成培养基涂布10⁶~10⁷孢子，于25 ℃，培养45-60 d生长子实体，收集子实体提取胞内虫草素，测定其含量。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤①中固体培养基为葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、琼脂粉30 g/L。