[发明专利]一种水稻核雄性不育保持系的回交转育方法

权利要求书

1.一种水稻核雄性不育保持系的回交转育方法，其特征在于，包括：

（1）以性状优良、基因型为aaTt且含有完整载体元件的核雄性不育中间保持系为母本，以性状优良、基因型为AAtt或Aatt的株系作为轮回亲本，杂交后获得F1代种子；

所述的载体元件包括育性恢复元件、花粉致死元件和筛选标记元件；

所述筛选标记元件包括荧光蛋白元件、苯达松敏感元件和双草醚抗性元件；

选择基因型为aaTt、荧光种子与非荧光种子比例为1:1、不育与可育花粉比例为1:1、苯达松敏感、抗双草醚、综合农艺性状优良的核雄性不育中间保持系作为母本；

所述轮回亲本为基因型为Aatt的核雄性不育杂合株系、基因型为AAtt的三系保持系、基因型为AAtt的两系不育系或基因型为AAtt的具有不育系特征特性的常规稻；

（2）对F1代至BC_n-1F1代植株进行筛选，保留基因型为AaTt的F1代至BCn-1F1代植株为母本，继续与轮回亲本回交，经过多轮回交，筛选得到基因型为AaTt的BCnF1代种子；

所述筛选包括选择抗双草醚、苯达松敏感、基因型为AaTt、表型与轮回亲本相似且可育与不育花粉比例为1：1的单株作为母本；

（3）种植所述BCnF1代种子，经过一轮或多轮自交，筛选得到性状优良、表型稳定、基因型为aaTt的核雄性不育保持系；

其中，A代表核雄性不育位点野生型等位基因，a代表核雄性不育等位基因；T代表含有载体元件，t代表不含有载体元件。

2.根据权利要求1所述的回交转育方法，其特征在于，步骤（1）中，先对核雄性不育中间保持系进行筛选后，再作为母本与轮回亲本杂交；

其中，所述筛选包括：

①种子阶段：对完熟的核雄性不育中间保持系每一单株均随机挑选部分干种子进行荧光色选，剩余种子备用；淘汰荧光种子发光不明显单株种子，播种荧光种子发光明显且荧光种子与非荧光种子比例1:1的单株的荧光种子和备用种子；

②秧苗阶段：

荧光种子的秧苗于3-4叶期，用含有苯达松或相似化学作用成分的除草剂作为筛选剂进行喷施，验证了苯达松敏感元件在转基因植株中是否正常工作；

备用种子秧苗于2-3叶期，以含有双草醚的除草剂或相似化学作用成分的物质作为筛选剂进行喷施，筛选得到存活的转基因植株，将存活的备用种子秧苗进行移栽；

③孕穗阶段：挑选株高偏矮-中、株型紧凑、剑叶直立、分蘖中-多、茎秆壮和/或韧性好的优异单株取叶片，提DNA，利用PCR进行载体元件鉴定，保留各元件均存在单株继续下一步试验；

④抽穗阶段：对孕穗阶段经PCR检测确定各元件均存在单株继续进行表型选择，挑选柱头外露高、包颈较轻单株取成熟颖花，进行花粉碘染，保留不育花粉与可育花粉比例为1:1单株备用。

3.根据权利要求1~2中任一项所述的回交转育方法，其特征在于，在步骤（2）~（3）中，所述筛选包括：前景选择和表型选择；

其中，所述前景选择的目标基因包括：A-核雄性不育位点野生型等位基因、a-核雄性不育等位基因和T-含有所有载体元件。

4.根据权利要求3所述的回交转育方法，其特征在于，在步骤（2）~（3）中，所述筛选还包括背景选择。

5.根据权利要求3所述的回交转育方法，其特征在于，在步骤（2）~（3）中，所述筛选包括：

种子阶段：对每一单株均随机挑选若干粒干种子进行荧光色选，剩余种子备用；淘汰荧光种子发光不明显单株种子，播种荧光种子发光明显且荧光种子与非荧光种子比例符合1:1的种子；

秧苗阶段：秧苗于2-3叶期进行双草醚喷施实验，杀死非转基因植株，并移栽；

秧苗-孕穗阶段：秧苗期全部植株或孕穗期挑选部分综合农艺性状与轮回亲本相似的单株，取叶片提DNA，利用PCR进行载体元件鉴定，保留各元件均存在的单株；

抽穗阶段：选择经秧苗阶段和孕穗阶段筛选保留下的单株取成熟颖花，进行花粉碘染，保留不育花粉与可育花粉比例符合1:1的单株备用。