[发明专利]一种重组犬长效干扰素α的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组犬长效干扰素α的制备方法，所述融合蛋白通过将犬干扰素α和标签蛋白类弹性蛋白多肽ELP(ELP)进行融合表达的方式，在保留干扰素活性的情况下，延长其半衰期，增加其稳定性。所述重组犬长效干扰素α较普通犬干扰素的半衰期提高4倍以上，并且重组蛋白为可溶性表达，可以利用可逆相变循环(ITC)进行蛋白质分离纯化，过程简单而廉价。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种重组犬长效干扰素α的制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，宠物逐渐成为人们生活的一部分。其中，作为主流宠物的犬养殖数量快速增长。但各种病毒性传染病一直困扰着宠物犬主人及各类犬舍。常见宠物犬类疾病包括犬瘟热，犬细小病毒，犬传染性肝炎和犬冠状病毒感染等，具有传染率高，死亡率高的特点。

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有抗病毒活性的糖蛋白，干扰素不仅有良好的抗病毒和抑制病毒复制等治疗作用，还具有免疫增强功能，同时无污染、无残留且无耐药性。相较于使用抗生素，干扰素的治疗效果更好，在兽医临床治疗中应用率高，它可以有效地防止抗生素滥用后对犬类产生的危害以及降低耐药性的发生率；此外，并未发现干扰素存在明显的使用配伍禁忌，可与其他类药物配伍使用。干扰素在使用效果上具有高效性以及多效性特点，在用于动物治疗与预防方面，作用效果显著。尤其是对犬细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等疾病的治疗具有一定的疗效。

近20年来，随着基因工程技术的发展，干扰素成为第一个被应用于临床的基因重组细胞因子，发挥着抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等作用，其中犬重组α干扰素已广泛用于犬类疾病的治疗。由于干扰素分子量小，易被肾小球滤过，在体内不稳定，因此现有的犬干扰素多为短效干扰素，体内半衰期短，需要多次重复注射才可以治愈病毒性疾病，并且市面上重组干扰素在大肠杆菌中多以包涵体形式表达，因此需要经历变性复性，亲和纯化，透析等过程纯化的制备，在此过程中，蛋白损耗量大，得率低，纯化过程复杂且成本高。因此，改善重组干扰素的药代动力学与药效动力学的研究成为势在必行，其主要手段有融合蛋白，化学修饰等，常见的方法有聚乙二醇化，白蛋白融合。聚乙二醇化虽然能保护蛋白不被蛋白酶降解，延长了半衰期，但同时PEG也降低了蛋白的活性。白蛋白是由586个氨基酸组成的无酶学与免疫学活性的单链球形蛋白质，是理想的改善蛋白药物半衰期的蛋白，但是白蛋白影响了干扰素Cysl和Cys96二硫键的稳定性，在半衰期大幅延长的同时，药物的体外活性也大幅降低，不利于在家畜临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组犬长效干扰素α的制备方法，所述重组犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高4倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

为了解决现有技术的问题，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种重组犬长效干扰素α的制备方法，通过将犬长效干扰素α和标签蛋白类弹性蛋白多肽ELPELP进行融合表达的方式，在保留干扰素活性的情况下，延长它的半衰期，增加其稳定性。

进一步地，所述的类弹性蛋白多肽ELP为一类具有可逆相变特性的融合标签，所述的类弹性蛋白多肽ELP为五肽聚合物，所述的五肽聚合物分别由50-90个重复的VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)组成，其中Xaa为客座氨基酸。

进一步地，所述的客座氨基酸为脯氨酸以外的任何氨基酸。

更进一步地，所述的客座氨基酸为组氨酸。

本发明尝试过40、50、60、70、80、90、100个重复的VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)组成，发现50-90个重复的VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)组成效果较好，其中80个重复的VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)组成效果相对更好。对于客座氨基酸，本发明尝试过酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、以及芳香族氨基酸等20种均有一定效果，其中以为组氨酸为一个较好的选择。