[发明专利]一种多孔平底容器及样品成像检测方法

说明书

本申请公开了一种多孔平底容器，包括开口容器和环绕组件，其中，所述开口容器包括底板以及边缘外壁，所述边缘外壁环绕所述底板的边缘设置，所述开口容器内设置有多个依次排列设置的平底样品池，所述平底样品池由所述底板与位于所述底板上的边缘加强筋和内孔加强筋围绕形成或所述平底样品池由所述底板与位于所述底板上的内孔加强筋围绕形成；所述环绕组件沿所述边缘外壁的顶部设置。本申请所述的多孔平底容器，具有极佳的底部平整度、机械强度、导热均一性、密封隔热性和防污染性能，可满足微液滴式数字核酸扩增精确温控反应和检测的需求，实现对平底样品池内的微液滴进行快速精确程序温控，以及大面积无畸变正置成像检测。

技术领域

本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种多孔平底容器及样品温控反应和成像检测方法。

背景技术

微液滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)技术是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。相较于定量PCR(quantitative PCR,qPCR)，其在精密度、准确度和灵敏度方面具有显著的优势；同时，ddPCR消除了对定量标准曲线的依赖，提高了对扩增抑制物的耐受能力；因此，ddPCR被称作第三代PCR技术。基于ddPCR类似原理还发展了一系列等温数字核酸扩增(digital isothermal nucleic acidsamplification,dNAA)技术，包括数字RPA(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)，数字LAMP(digital loop-mediated amplification,dLAMP)等。上述技术统称为数字核酸扩增技术。

ddPCR的工作原理是在PCR扩增前对反应液进行微滴化处理，即将含有核酸模板的反应液分散成数万个纳升级的微液滴，每个微液滴不含或含有一至数个待检核酸靶分子，且每个微液滴都作为一个独立的PCR反应单元。经PCR扩增后，含有待检核酸靶分子的微液滴产生荧光信号，不含待检核酸靶分子的微液滴不产生荧光信号。最终根据泊松分布原理以及阳性微液滴的比例，计算出待检核酸靶分子的起始浓度或拷贝数。

微量多孔板(Microwell Plate)是现代生化分析、高通量筛选和临床诊断实验的一种标准化工具，广泛应用于酶联免疫分析(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay,ELISA)、定量聚合酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、细胞培养、组织培养、药物筛选、晶体生长等技术领域。对微量多孔板孔内的生物样品，如细胞、组织、微液滴阵列等，通常需要进行实时荧光或明场成像观察和图像分析，以分析在相关反应或刺激条件下生化反应的过程。目前，绝大多数微量多孔板采用透明平整底部设计以进行倒置显微明场或荧光成像分析。

当微量多孔板配合液滴加样针，应用于微液滴式数字PCR时，需要在孔板底部设置不透明的导热温控加热模块以实现孔内微液滴的程序温控操作，而此操作导致无法从底部同时进行倒置成像分析。同时数字PCR温控扩增过程中还存在产生气泡，产生气溶胶污染等一系列难题，具体包括如下几个问题：

(1)在向多孔板中加入液滴时，难以精确控制添加到孔内的液滴数量，导致难以在面积固定的孔底部形成单层平铺液滴阵列。液滴过多会出现液滴重叠，导致成像分析结果不理想；液滴过少时，会导致单层液滴阵列出现空洞，影响数字PCR检测的精密度。

(2)进行数字PCR温控时，目前常用的绝大多数孔板所采用的塑料材料往往导热性能较差，导致对孔板进行程序温控操作时，升降温速度缓慢；而导热性能良好的金属材料，往往无法透光，并且金属材料会反射明场光源和荧光激发光源发射的光，影响正置成像分析。

(3)进行数字PCR温控时，导热性能良好的金属材料制成的多孔板与高温热盖接触时会迅速向下传导热量，导致多孔板孔间温度不均一；此外，导热性能良好的金属材料制成的多孔板如结构设计不合理，在成型制备过程中往往出现应力释放和弯曲，底面难以保持高度平整，使其与温控加热模块间存在间隙，导致多孔板孔间温度不均一。