[发明专利]靶向沉默BRD4基因表达的shRNA序列及其用途

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向沉默BRD4基因表达的shRNA序列及其用途。本发明基于BRD4基因的mRNA序列设计并合成shRNA分子，并构建shRNA的寡核苷酸序列，shRNA序列通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人小细胞肺癌细胞，能够与BRD4基因的mRNA结合，高效地干扰其转录和翻译，降低BRD4基因在小细胞肺癌细胞中的表达，抑制小细胞肺癌细胞的增殖。本发明提供的shRNA序列在将为以BRD4抑制剂为核心的小细胞肺癌治疗新策略提供理论基础，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗癌基因药物，尤其针对小细胞肺癌基因药物的研发，具有巨大的社会和经济效益。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向沉默BRD4基因表达的shRNA序列及其用途。

背景技术

肺癌是目前最为常见的恶性肿瘤，其死亡率居恶性肿瘤之首。肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），后者约占所有肺癌病例的12-14％。SCLC最显著的特征之一是某些重要基因突变频率高，如肿瘤蛋白53基因（TP53）的突变率为75%–90%，视网膜母细胞瘤1（RB1）基因的突变率接近100%。目前在临床上，SCLC最常用的治疗方法包括手术、化疗和放疗等。SCLC初期对化疗和放疗比较敏感，但由于SCLC倍增时间短，恶性程度高，非常容易发生耐药和复发，绝大多数患者的诊断后生存期短，预后较差。目前，与其它肿瘤相比，SCLC的治疗方式仍比较局限单一，对病人的生存期改善效果也不明显。因此，迫切地需要找到更多安全有效的药物靶向，以提高SCLC患者的生存期。

溴结构域蛋白4（BRD4）位于染色体19p13区，是溴结构域和超末端结构域家族重要的功能蛋白。在SCLC中，BRD4可直接结合于无刚毛鳞甲复合体样1（ASCL1）基因的增强子上，进而促进SCLC的发展；ASCL1的表达水平与SCLC细胞对BRD4的抑制剂JQ1的敏感性有关。BRD4抑制剂ABBV-075可通过诱导Caspase3/7活性、促进前凋亡蛋白BIM的表达、促进Bcl2-BIM复合物的形成等方式，引发细胞凋亡。

RNA干扰技术(RNAi)是一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。短发夹核糖核酸（shRNA）可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。

shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。在内切核酸酶Dicer作用下，shRNA被裂解成21-25nt的核苷酸链，由正义链和反义链组成。反义链与特定的酶结合形成由RNA诱导的沉默复合物RISC（RISC复合物中含siRNA、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件），核苷酸双链会被活化后的RISC解聚成为两条单链，随后反义链识别并结合与其同源的靶mRNA，在反义链的引导下活化型RISC会切割靶mRNA的特定位置，同时切割的mRNA会被RISC复合物中的酶特异性降解，从而阻断mRNA的遗传信息传递。但如何利用shRNA技术，研究出特异性针对小细胞肺癌细胞的shRNA，对于小细胞肺癌的预防或治疗具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供靶向沉默BRD4基因的shRNA序列及其应用。本发明根据沉默BRD4基因对小细胞肺癌增殖方面的影响，判断沉默BRD4基因的shRNA序列的特异性，验证可沉默BRD4基因的shRNA序列对小细胞肺癌细胞的抑制作用。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种靶向沉默BRD4基因表达的shRNA序列，所述的shRNA记为shBRD4-1和shBRD4-2，所述shBRD4-1的序列如SEQ ID NO.1所示，shBRD4-2的序列如SEQ ID NO.2所示。