[发明专利]规模化生产凝血酶调节蛋白的方法

权利要求书

1.一种规模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：包括将凝血酶调节蛋白粗制品经过阴离子交换层析柱、亲和层析柱A、复合型亲和层析柱B、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，收集洗脱峰，超滤浓缩得到凝血酶调节蛋白精制品。

2.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：所述凝血酶调节蛋白粗制品是指经过硫酸铵沉淀的，比活性不低于1.0ug/E280的粗制品，上样前，超滤浓缩，调节pH为6.0-9.0，电导0.2-2mS/cm。

3.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：阴离子交换层析柱平衡缓冲液平衡后，上样凝血酶调节蛋白粗品，冲洗液冲洗，洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡缓冲液为0.05-0.25mol/L磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，含0-0.1MNaCl，pH为6.0-9.0，冲洗液为0.05-0.25mol/L磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，含0.1-0.3mol/LNaCl，pH为6.0-9.0，洗脱液为0.10-0.30mol/L磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，含0.1-0.5MNaCl，pH为5.0-6.0。

4.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：凝血酶调节蛋白粗制品的上样液中以及阴离子交换层析柱纯化过程中的平衡缓冲溶液中均加入蛋白保护剂。

5.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：阴离子交换层析柱层析后的样品洗脱液经过10-30kDa超滤膜超滤，调节pH为5.0-8.0，电导低于平衡液电导2-3mS/cm，上样平衡好的亲和层析柱A柱层析纯化，平衡液为0.02-0.2mol/L醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含0-0.5mol/LNaCl，pH为4.0-7.0，收集样品穿透液。

6.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：所述亲和层析柱A配基是是活性染料的复合型亲和柱，活性染料为Blue sepharose 6Fast Flow、AF Red-650ML。

7.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：亲和层析柱A的样品穿透液经过10-30kDa超滤膜超滤，调节pH为5.0-8.0，电导低于平衡液电导2-3mS/cm，上样平衡液平衡好的复合型亲和层析柱B层析纯化，上样结束后用pH为5.0-8.0的平衡液冲洗，然后冲洗液继续冲洗，最后用洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡液为含有0-0.1M NaCl的0.05M磷酸盐缓冲液；冲洗液为pH4.0-6.0的0.05M醋酸盐缓冲液，冲洗液含有0-0.2mol/L的氯化钠；洗脱液pH为4.0-6.0的0.05M醋酸盐缓冲液，洗脱液中含有0.1-0.5M NaCl。

8.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：所述复合型亲和层析柱B是以苯甲脒为配基的复合型亲和层析柱。

9.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：采用平衡好的凝血酶亲和层析柱，上样复合型亲和层析柱B层析后的样品洗脱液，上样前调节pH5.0-8.0，上样后利用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡液为pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs缓冲盐，含有0-0.08MNaCl，冲洗液为pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs缓冲盐，含有0.05-0.15MNaCl，洗脱液为pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs缓冲盐，含有0.2-1.0MNaCl。

10.根据权利要求1所述模化生产凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于：所述凝血酶亲和层析柱配基是凝血酶，凝血酶为源于人血浆、牛血浆、猪血浆和细胞表达重组型凝血酶。