[发明专利]一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用

权利要求书

1.一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，表达了(a)或(b)，并表达了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶；其中，

(a)伸长盐单胞菌来源的EctABC基因簇；

(b)编码伸长盐单胞菌来源的二氨基丁酸转乙酰基酶、二氨基丁酸转氨酶和四氢嘧啶合成酶的基因。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还替换了编码二氨基丁酸转乙酰基酶的基因ectA、编码二氨基丁酸转氨酶的基因ectB及编码四氢嘧啶合成酶的基因ectC的RBS序列。

3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，以载体pRSFDuet-1表达所述基因。

4.根据权利要求1～3任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，宿主为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

5.根据权利要求1～4任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还抑制了ptsG，pta，thrA和lysA中至少一个基因的表达。

6.构建权利要求1～5任一所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以线性化的质粒pRSFDuet-1表达EctABC基因簇，获得重组质粒pR-ABC，并转化至E.coli BL21(DE3)感受态得到重组菌株E/pR-ABC；

(2)分别替换pR-ABC上ectA，ectB和ectC基因的RBS序列，获得重组质粒R-AB，再将重组质粒R-AB转化至E.coli BL21(DE3)感受态，得到重组菌株ECT-AB；

(3)将天冬氨酸激酶基因连接至表达载体R-AB的第二个T7启动子表达框处，并对第932位氨基酸进行定点突变，得到重组质粒R-AB-L，再将重组质粒R-AB-L转化至E.coli BL21(DE3)感受态，得到重组菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)后，设计以micC为骨架靶向基因ptsG，pta，thrA或lysA的sRNA序列，合成并插入到质粒R-AB-L中，得到重组质粒R-AB-L-micC，再转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。

8.权利要求1～5任一所述的大肠杆菌工程菌在制备四氢嘧啶或含四氢嘧啶的产品中的应用。

9.一种生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述的大肠杆菌工程菌在含酵母提取物、蛋白胨、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、FeSO₄、葡萄糖的培养基中发酵。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵在28～37℃下进行；

可选地，控制发酵体系的溶解氧维持在25-35％，控制pH维持在7.0-7.2。