[发明专利]一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中过表达了赖氨酸脱羧酶cadA、丁二胺转氨酶patA、γ-氨基丁醛脱氢酶patD、4-氨基丁酸转氨酶gabT和琥珀酸半醛脱氢酶gabD；

所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；丁二胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；γ-氨基丁醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；4-氨基丁酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述丁二胺转氨酶通过核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核糖体结合位点与表达载体相连，所述γ-氨基丁醛脱氢酶是通过核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核糖体结合位点与表达载体相连。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌E. coli W3110、E. coli MG1655、E. coli B0013或E. coli ATCC 8739。

4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述表达载体为pETM6R1、pCDR或pCOR。

5.一种权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）获得赖氨酸脱羧酶cadA、丁二胺转氨酶patA、γ-氨基丁醛脱氢酶patD、4-氨基丁酸转氨酶gabT和琥珀酸半醛脱氢酶gabD的单基因表达载体；

（2）将步骤（1）得到的单基因表达载体采用ePathBrick技术对路径酶进行组装，得到重组质粒；

（3）将步骤（2）所得的重组质粒转化到大肠杆菌宿主中，得到大肠杆菌重组菌。

6.权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌在生产戊二酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用具体是将所述重组大肠杆菌按照5-10%的接种量接种至发酵培养基中进行培养，培养4-8 h，添加0.1-0.4 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为25-30 ℃；在发酵过程中，当溶氧急剧上升，开始进行葡萄糖补料，并每隔10-20h补加L-赖氨酸持续至发酵结束。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40-60 g/L，蛋白胨15-25 g/L，酵母提取物5-15 g/L，十二水磷酸氢二铵2-3 g/L，磷酸二氢铵0.5-1.5 g/L，氯化钾0.1-0.2 g/L，七水硫酸镁0.2-0.4 g/L，和0.5-1.5 mL 微量金属溶液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微量金属溶液包括如下组分：六水氯化铁2-3 g/L，六水氯化钴0.2-0.4 g/L，氯化铜0.2-0.4 g/L，四水氯化锌0.2-0.4 g/L，高锰酸钠0.2-0.4 g/L，硼酸0.07-0.08 g/L，和四水氯化锰0.4-0.6 g/L。