[发明专利]重组人促卵泡激素及其制备方法

权利要求书

1.一种重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将构建的含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体联合转染到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选出稳定表达的细胞株，纯化培养所述细胞株培养液，得到所述重组人促卵泡激素；其中，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP。

2.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述FSHα亚基的编码区基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP的编码区基因序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述含FSHα亚基的表达载体的构建过程为：

将FSHα亚基基因序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHα亚基基因，再将酶切后的所述FSHα亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α。

4.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述含FSHβ亚基的表达载体构建过程为：

以第一引物、第二引物和FSHβ亚基基因为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段；

以第一引物、第三引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第一延长段；

以第一引物、第四引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段延长段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第二延长段；

以第一引物、第五引物和所述FSHβ亚基DNA片段第二延长段为模板PCR扩增，得到C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因；

将所述C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因克隆至表达载pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHβ亚基基因，再将酶切后的所述FSHβ亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α；

其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

5.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述联合转染过程包括：

将所述含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体转化至大肠杆菌，得到具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌，再将具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌转染至CHO-S细胞。

6.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述纯化培养所述细胞株得到培养液过程包括：

将所述培养液的上清液经过亲和层析、疏水层析、混合模式层析、阳离子层析，将得到的层析液浓缩得到重组人促卵泡激素。

7.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述亲和层析柱的填料为针对FSH全分子的特异性CaptureSelect填料；

所述疏水层析柱的填料为Butyl-650M；

所述混合模式层析柱的填料为Capto Adhere；

所述阳离子交换层析柱的填料为CM Sepharose Fast Flow。

8.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述制备方法还包括：

在上样阳离子交换层析柱之前和过阳离子交换层析柱之后，采用截留分子量为10kD的超滤膜对所述层析液进行超滤浓缩。

9.如权利要求8所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述超滤浓缩得到浓缩液的浓度为0.8～1.5mg/mL。

10.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，

所述上清液的浊度＜10NTU。