[发明专利]重组刺突蛋白及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种重组刺突蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或3所示。本发明还公开了编码所述重组刺突蛋白的核酸序列（如SEQ ID NO：2或4所示）、所述重组刺突蛋白的制备方法及用途。所述重组刺突蛋白可用于预防新型冠状病毒感染或由该病毒感染导致的疾病。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种重组刺突蛋白、其制备方法和用途。

背景技术

新冠肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的呼吸道疾病。截止到2020年10月，全球范围内已有超过40,000,000人感染，超过1,100,000人因感染SARS-CoV-2病毒而死亡。新冠肺炎在全球范围内的大流行已经对人类的健康和经济发展带来了巨大的影响。因此，迫切需要寻求一种途径遏制病毒的传播。疫苗是一种有效且经济的预防SARS-CoV-2病毒感染及新冠肺炎的方式。

SARS-CoV-2属于β属B亚群，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。该病毒属还包含SARS-CoV和MERS-CoV，它们都是通过病毒颗粒表面的刺突蛋白（Spike，以下简称S蛋白）与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2）结合而感染宿主。天然状态下，病毒表面的S蛋白呈现三聚体状态，根据蛋白的结构功能，S蛋白可以被分成两个功能单位：S1和S2蛋白亚基，S1亚基的主要功能是介导与宿主细胞表面受体结合，S2亚基的功能是介导病毒与宿主细胞的融合，主要的中和抗原表位集中在S1亚基的受体结合结构域（Receptor bindingdomain，RBD）上。因此，S蛋白的完整性和结构的正确性确保了疫苗的有效性。但在病毒感染细胞的过程中，处于融合前构象（pre-fusion）的天然S蛋白首先被蛋白酶水解成S1亚基和S2亚基，S1亚基发生解离，S2亚基上的蛋白酶水解位点则暴露出来，导致其进一步被蛋白酶水解，使得位于分子内部的融合肽暴露出来，蛋白构象则转变成融合后构象（post-fusion），进而介导病毒和细胞膜的融合。如果保持S蛋白原有的氨基酸序列进行S蛋白的重组表达，由于表达细胞中蛋白酶的存在，S蛋白很可能被水解而难以保持融合前构象，导致S蛋白表达水平降低，并且不利于其结构的正确性。因此，在以S蛋白作为抗原的SARS-CoV-2病毒疫苗中，需要通过基因工程手段对S蛋白进行改造，一方面保持S蛋白的表达水平，确保疫苗产业化的可行性；另一方面保证S蛋白结构的正确性，确保疫苗的有效性；此外，通过体外重组方式表达、制备的S蛋白，不含SARS-CoV-2病毒的遗传物质，则保证了疫苗的安全性。

发明内容

在本发明的第一方面，提供了一种经基因工程手段改造的重组S蛋白。具体而言，首先将S1/S2酶切位点进行替换，阻止蛋白酶的切割；接着为了进一步阻止分子由融合前构象转变成融合后构象，在关键位点引入连续两个脯氨酸（Pro，P）突变，从而增加其结构刚性。在一个优选的实施方式中，所述重组S蛋白具有SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列。在一个进一步优选的实施方式中，所述重组刺突蛋白分别由SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列编码。

在本发明的第二方面，提供了一种编码第一方面的重组S蛋白的基因。在一个优选的实施方式中，所述基因具有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种工程化细胞，在一个进一步优选的实施方式中，所述细胞基因组中整合有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。在一个进一步优选的实施方式中，所述细胞能够分泌表达重组S蛋白。在一个优选的实施方式中，所述工程化细胞为CHO细胞。在一个优选的实施方式中，所述CHO细胞的培养上清液中重组S蛋白的平均表达量达到200-300mg/L。

在本发明的第四方面，提供了一种通过CHO细胞分泌表达并分离第一方面的重组S蛋白的方法，包括以下步骤：

(1) 将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆入表达载体中；

(2) 将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；