[发明专利]一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法

说明书

一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，它涉及生物领域。本发明要解决目前还没有技术定向分选脐带血特异性外泌体的问题。本发明采取特定刺激活化后的脐带血NK细胞时期的细胞外泌体分离，利用IL‑2使NK细胞增殖，IL‑12、IL‑15、GM‑SCF和Fit3‑L能够促进NK细胞活化，并可以诱导CD34supgt;+/supgt;干细胞向NK细胞分化。并在体外培养第10d左右分选收集NK细胞，以获得更多量的NK细胞分泌的外泌体。本发明利用创新优化NK细胞因子培养法与饲养法特点，规模化提取活化后的NK细胞外泌体，并用来达到活化NK细胞的目的。本发明应用于外泌体领域。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法。

背景技术

病毒感染或者肿瘤发生的发病机制主要是由于机体的免疫能力无法战胜病原微生物或清除肿瘤细胞所致。人体自然杀伤细胞(NK细胞)是机体自身具有的自然杀伤性的免疫细胞，是抵御病毒感染以及清除衰老病变细胞的第一道防线，其在流感、HIV等重大病毒性传染病治疗及抗肿瘤发生过程中有明确的作用，主要免疫学特点是产生细胞因子，并通过分泌细胞因子IFN-γ等介导细胞毒活性，以及通过释放穿孔素和颗粒酶介导对靶细胞的杀伤，(Vivieret al.,2008)。NK细胞是固有免疫系统中的核心细胞，约占血液中白细胞的15％，对先天免疫和适应性免疫均至关重要，在防御病毒感染中不可或缺。

NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势。首先无需预先致敏就能引起非特异性杀伤肿瘤细胞和被病毒感染细胞的淋巴细胞。其次，NK细胞不受主要组织相容性复合物(MHC)限制性开启靶细胞杀伤作用，主要是通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF-α等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，从而可避免造成严重的细胞因子风暴。同时NK细胞还可通过表面抗原与特异性抗体Fc片段结合，诱发抗体依赖的的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。因此利用NK细胞以及相关技术干预病毒感染与肿瘤疾病将有创新现有的生物治疗方式与手段。

然而在免疫力低下的患者身体内NK细胞的数量、抵抗病毒的能力也随之下降。目前在临床造血干细胞移植的过程中，NK细胞可以发挥移植物抗白血病细胞的能力，而不会引起移植物抗宿主病的发生(Ruggeri et al.,2002)。此外，NK细胞输注可以使血液肿瘤病人的病情缓解(Miller et al.,2005)。因此，目前NK细胞是进行血液肿瘤治疗的非常有前景的免疫细胞。然而，由于NK细胞应用的限制因素，临床应用方面仍然存在着一些尚未解决的问题。例如，从原代NK细胞扩增或由干细胞分化扩增获得足够数量的杀伤性较强的NK细胞是促进NK细胞临床应用及提高治疗疗效的前提(Cheng et al.,2013；Luevano et al.,2012)。其次，非特异的细胞毒性、生物安全性差、送效率低等问题，细胞制剂输注后由于体内的免疫系统的作用在体内很快被清除。(人体血脑屏障，组织生理结构，免疫微环境影响造成免疫细胞无法作用到靶细胞中去，细胞之间无法接触。同时细胞免疫治疗靶向性不强)想要完全消除免疫反应的影响，唯一的方法就是使用人源性的纳米级载体。

外泌体(Exosomes)是由各种活细胞主动分泌方式通过内吞、融合、外排等一系列生物学机制产生分泌、直径约为30-200nm、在蔗糖梯度中浮力密度在1.10-1.21g/mL之间的膜性囊泡，主要为磷脂双分子层结构。Exosomes天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等。外泌体大小相对均一，呈“杯”形或“双凹碟形”，在人体体液中呈球状。