[发明专利]一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，通过该胶质瘤细胞构建胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建，借用双光子活体成像技术研究胶质瘤细胞在小鼠大脑中的动态发展变化。本发明中改造得到的GL261‑ZsGreen胶质瘤细胞，能够非常成功地用于构建胶质瘤原位移植活体动物模型，在成像观测过程中可以清楚的观察到肿瘤细胞所存在的位置，应用在研究领域可以精准地进行细胞层面的检查，并且可以明显地区分胶质瘤边界，为有效地精准切除肿瘤提供了一种潜在的手段。本发明中增殖的每一个GL261‑ZsGreen癌细胞都带有绿色荧光标记，可以实现对分散转移的单个癌细胞进行精确定位，为进一步研究癌细胞的扩散和胶质瘤的精准治疗提供了可能的方案。

技术领域

本发明属于生物学和肿瘤学技术领域，特别涉及一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建及应用。

背景技术

神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发型肿瘤，具有复发性高、预后效果差、患者的死亡率高等特性，严重威胁着患者的生存时间和质量，且目前对于胶质瘤还没有特别有效的治疗策略。近年来，脑肿瘤发病率呈上升趋势，很多脑肿瘤，尤其是星形胶质细胞瘤，在被诊断发现后已经很难通过手术方法彻底地治疗，且预后效果也很差，因此神经胶质瘤的早诊断、早治疗对于改善神经胶质瘤患者生存期起着至关重要的作用。

目前临床上应用的神经胶质瘤检测诊断技术主要依靠磁共振、计算机断层扫描等大型仪器设备,这些检测诊断技术只能对病灶区起到定位和定性的检查作用。在医学研究过程中，对于神经胶质瘤主要采用组织切片及常规的免疫组织化学染色方法进行成像研究，而不能动态监测单个的肿瘤细胞在活体组织中的动态发展和变化。针对神经胶质瘤，目前还缺乏在活体动物中从单个细胞水平监测、研究神经胶质瘤发展、变化的实用方法和技术，难以精准识别神经胶质瘤边界，并且无法清楚地追踪发生转移扩散的单个神经胶质瘤细胞，给神经胶质瘤的研究和医学诊断乃至治疗过程都造成了很大的困难。

近年来，由于双光子荧光显微镜在活体动物成像中的应用，能够直接在活体动物体内观察生物组织深处的亚微米荧光结构。由于双光子显微镜使用的是近红外光作为激发光源，因而受生物组织散射的影响更小，具有更强的穿透能力，大大提高了成像深度，适用于长时间的动态观察研究。在成像时，由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的范围内，因而具有很高的成像分辨率。鉴于双光子的这些优点，使得双光子活体显微成像技术在生命科学研究领域应用得越来越广。但是该技术对成像的样品有一定要求，即样品必须要有双光子激发波段才能进行双光子显微成像。因此，为了在活体动物内动态监测肿瘤细胞，建立一种适于双光子活体成像的胶质瘤细胞系成为一种迫切的需求。

在这里，我们利用慢病毒(Lentivirus)载体构建了一种表达绿色荧光并且适用于双光子活体成像的胶质瘤细胞系。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因有效地整合到宿主细胞的基因组中，可有效感染分裂的细胞和非分裂的细胞，能大大提高目的基因的转导效率，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。利用慢病毒载体，我们成功将具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因整合到了胶质瘤细胞系，并利用该细胞系构建了稳定的胶质瘤原位移植动物模型，借助双光子活体荧光显微技术实时地观察到了神经胶质瘤细胞在活体动物内的动态发展变化。该发明的应用不仅实现了在活体动物内对神经胶质瘤细胞的高分别率成像，追踪单个癌细胞的增殖、迁移和扩散，而且为胶质瘤发生发展的机理研究及胶质瘤治疗药物的开发提供了一种强大的工具。

发明内容

发明目的是构建一种表达绿色荧光蛋白的神经胶质瘤细胞系，应用该细胞系进行胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建，借助双光子活体成像技术在细胞水平实现对神经胶质瘤动态监测和研究。

本发明采用以下技术手段：一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，包括以下步骤：