[发明专利]用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记、特异性引物和方法

说明书

本发明涉及微生物分子生物学检测技术领域，具体涉及用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记、特异性引物和方法。本发明发现位于葡萄糖‑6‑磷酸异构酶pgi基因到乙酰辅酶A乙酰转移酶ACAT基因的基因组区段内的2个基因排列区及16个单基因具有拟分枝杆菌属特异性，可用于拟分枝杆菌属水平的鉴定，其中部分单基因还具有拟分枝杆菌种水平特异性，可用于拟分枝杆菌种水平的鉴定。基于此，本发明建立了利用PCR技术鉴定拟分枝杆菌的方法，可直接根据PCR扩增结果进行判断而无需测序，更适用于临床样本的特异性快速检测，可广泛应用于拟分枝杆菌的临床检测和鉴定以及结核病的辅助诊断和流行病学监测等相关领域。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测技术领域，具体涉及用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记、特异性引物和方法。

背景技术

分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和非结核分枝杆菌（Non-tuberculosis mycobacteria，NTM），迄今已有近200个菌种及亚种。其中，结核分枝杆菌可感染人和动物，引起结核病。非结核分枝杆菌广泛分布于水生和陆地环境中，其中的许多菌种能在人和动物中引发严重的疾病。结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌在形态、染色、培养条件上很相似，但耐药谱上差别很大，非结核分枝杆菌通常天然对一线抗结核药物耐药。在AIDS患者中25-50%的患者合并有非结核分枝杆菌感染，而30%的多耐药患者实际是结核和非结核分枝杆菌的混合感染。混合感染严重增加了治疗的难度。准确快速的区分鉴定结核和非结核分枝杆菌是实现全球终结结核病计划的首要条件。

2018年，利用分子遗传学方法，对分枝杆菌进行了重新分类，将现有分枝杆菌属的菌种按照5个单系进化群重新分类，分别为分枝杆菌属（Mycobacterium）、分枝菌酸小杆菌属（Mycolicibacillus）、分枝菌酸杆菌属（Mycolicibacter）、分枝菌酸杆形菌属（Mycolicibacterium）和拟分枝杆菌属（Mycobacteroides）。拟分枝杆菌属是快生型非结核分枝杆菌，包括8个菌种，分别为脓肿拟分枝杆菌（M. abscessus）、龟拟分枝杆菌（M.chelonae）、富兰克林拟分枝杆菌（M. franklinii）、免疫反应拟分枝杆菌（M.immunogenum）、嗜鲑鱼拟分枝杆菌（M. salmoniphilum）、圣保罗拟分枝杆菌（M.saopaulense）、丝背细鳞鲀鱼分枝杆菌（M. stephanolepidis）和M. fukienense。其中，脓肿拟分枝杆菌（M. abscessus）、龟拟分枝杆菌（M. chelonae）、富兰克林拟分枝杆菌（M.franklinii）和免疫反应拟分枝杆菌（M. immunogenum）都是临床样本中十分常见的非结核分枝杆菌菌种。而且龟拟分枝杆菌是引起皮肤和软组织结核的最主要的菌种。因此，拟分枝杆菌属是一个临床上有重要意义的非结分枝杆菌属。

分枝杆菌的培养条件及临床治疗药物不同于其他细菌。由于生长缓慢，所有基于分枝杆菌培养的传统实验，包括表型鉴定、生化检测及药敏实验都是非常耗时的，一般需要约3-6周，而且常常数周后也难以得到明确的结果。因此，分子生物学的鉴定方法在结核病的诊断中起着重要的作用。基于新的分枝杆菌分类，有必要建立相应的新的鉴定方法，以便于结核/非结核分枝杆菌的快速诊断及鉴别诊断。

发明内容

本发明的目的之一是提供葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi至乙酰辅酶A乙酰转移酶ACAT的基因组区段内的基因或基因排列区在拟分枝杆菌属水平或种水平鉴定中的应用，本发明的另一目的是提供用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记和特异性引物以及利用该特异性引物进行拟分枝杆菌属水平或种水平鉴定的方法。