[发明专利]一种生产高聚合度多聚磷酸盐的方法

权利要求书

1.一种不同链长polyP_n的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）活化转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）；

所述转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌是以弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090为宿主，并导入了宿主自身的多聚磷酸盐激酶编码基因Ppk1；所述弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA中只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶编码基因，且所述多聚磷酸盐激酶编码基因Ppk1在基因组上与外切聚磷酸酶编码基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录；

（2）将活化后的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌转入发酵罐进行高密度发酵，将得到的发酵液离心，取菌泥沉淀，得到活性菌剂；

（3）将含磷培养基注入序批式生物反应器中，并投入活性菌剂使起始OD600为0.2-0.3；

（4）15-30℃室温条件下启动序批式生物反应器，培养16-19h后获得含多聚磷酸盐的菌液；

（5）将步骤（4）制得的含多聚磷酸盐的菌液离心并将菌泥-20℃冷冻，解冻后在70-100℃水浴加热10-30min，冷却至室温，10000g离心5min，取上清并测量体积，得V1；

（6）加入0.05V1体积的盐酸溶液，混合均匀并10000g离心20min，收集上清并用氢氧化钠溶液调节至中性，加入氯化钠使得混合液中氯化钠终浓度为100mM；

（7）分离中链多聚磷酸盐：上述溶液中加入96%乙醇并混合均匀，静置孵育1h后，10000g离心5min，沉淀为中链多聚磷酸盐；

（8）分离短链多聚磷酸盐：将步骤（7）离心后得到的上清收集，加入无水乙醇，充分悬浮；将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为短链多聚磷酸盐；

（9）分离长链多聚磷酸盐：将步骤（8）中离心后得到的上清收集，加入超纯水使得乙醇体积分数为70%，将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为长链多聚磷酸盐；50%乙醇轻柔洗涤，去除沉淀中的盐残余；产品放置在干燥器上，干燥一周；

所述短链表示聚合度小于15，中链表示聚合度为15-60，长链表示聚合度为60-130。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述高密度发酵的条件为：罐体装液量为70-80%，30-37℃好氧培养10-16h，所用培养基的配方为：酵母浸膏0.5-3%，蛋白胨0.5-3%，氯化钠0.5-2%，无机盐离子，pH调节至中性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述序批式生物反应器分三步操作：a.进水、预培养4-6h；b.连续进水、连续抽滤12-13h；c.菌体浓缩、菌体排放1-2h，曝气量为0.5-1L/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）具体是：LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h；按1%接种量接种至500mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述含磷培养基每升含：葡萄糖0.1-0.5g，蛋白胨0.05-0.3g，酵母粉0.01-0.1g，无水乙酸钠0.05-0.3g，氯化钠0.01-0.3g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，三水合磷酸氢二钾0.45-0.75g，氯化铵0.05-0.5g，含磷量为6-10mg/L。

6.权利要求1-5任一所述的方法在医疗、日化、食品领域中的用途，其特征在于，所述用途不以疾病的诊断或治疗为目的。