[发明专利]一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组山羊痘病毒

说明书

本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体。所述的转移载体主要包含：TK基因的左臂和右臂、两个逆向的p7.5K启动子及其分别调控的小反刍兽疫病毒H基因和F基因、p11K启动子、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因、两个顺向Loxp序列。所述的转移载体与山羊痘病毒在羊睾丸细胞内发生同源重组，获得表达eGFP的重组山羊痘病毒，在Cre酶作用下，eGFP基因被特异性敲除，获得潜在共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组山羊痘病毒。

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组羊痘病毒。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)，是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染所引起的急性或亚急性传染病，现为国际动物卫生组织(OIE)必须通报疫病。该病通过直接或间接接触传播，以呼吸道和消化道为主要感染途径，病原可通过眼鼻口分泌物及飞沫传播。该病最易感染绵羊和山羊，而山羊比绵羊、新生羊比成年羊更易发病，发病率较高，急性感染的死亡率可达100％。

PPRV属副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)成员。PPRV基因组为不分节段的单股负链RNA，全长15948nt。PPRV H基因开放阅读框(ORF)全长1830nt，编码病毒的H蛋白。该病毒全长609aa，分子质量约为68kD，属于II型糖蛋白。

成熟病毒粒子的H蛋白是由二硫键连接的两个同源二聚体，从而形成了一个铆钉样结构的四聚体，镶嵌在病毒囊膜表面。PPRV F基因较为保守，由2411nt构成。F蛋白由546个aa构成，分子质量约59kD。

成熟病毒粒子的F蛋白前体(F0)的104～108aa为蛋白水解区域，F0在该区域将被水解为由二硫键连接的F1和F2，其氨基酸切割位点及细胞蛋白酶的切割能力决定了病毒的毒力。PPRV的H和F蛋白是病毒的免疫保护性蛋白，在体内可诱导理想的免疫保护作用。

山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)属于痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员。GTPV基因组为两端共价闭合、线性双股DNA，对外源基因容纳性较高，若经适当修饰，可成为理想的活疫苗载体。胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因是痘病毒复制的非必需基因，因此作为同源重组基因广泛用于重组GTPV构建。外源抗原基因插入至TK基因会破坏其表达，但不显著影响重组GTPV的复制。若外源蛋白能在体内表达且诱导理想的免疫保护作用，重组病毒将是潜在的活疫苗候选株。

发明内容

本发明提供一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组羊痘病毒GTPV，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体，所述的重组转移载体携带氨苄青霉素抗性基因，还包含有如下的作用元件：TK基因的左臂(TK_L)和右臂(TK_R)；两个转录方向相反的p7.5K启动子；逆向的PPRV H和F基因；p11K启动子；增强型绿色荧光蛋白(eGFP)筛选marker；两个顺向Loxp序列。

所述的重组转移载体H和F基因上游皆为p7.5K启动子，下游皆为“ATTTTTAT”早期转录终止信号。

筛选标记marker为eGFP基因，受p11K启动子调控，使后期筛选更为便捷。eGFP基因和p11K启动子两端为两个顺向Loxp序列。

所述的重组转移载体，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；