[发明专利]一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.将从华山捕捉的一只药用昆虫鼠妇中分离、纯化得到昆虫内生真菌的菌块接种到土豆液体培养基中，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，再将培养好的液体发酵液适量倒入大米培养基中，28℃静置培养30天；

步骤2.将步骤1所得大米发酵物用甲醇浸泡两次，将真空浓缩干燥后的提取物萃取五次过滤浓缩后，真空浓缩干燥得棕色粗浸膏F；

步骤3.对步骤2所得浸膏F进行硅胶柱层析分段，采用50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚/乙酸乙酯和100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16的二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到7个组分F1-F7；

步骤4.对浸膏F1-F3、F6多次采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20以及反相C-18柱层析分离纯化得到含有7个新化合物的部位F1.1、F2.3、F3.2.2、F3.3.4和F6.1；

步骤5.对浸膏F1.1用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：乙腈/水＝18/82，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione B保留时间t_R＝16.5min；piterrione C保留时间t_R＝23.0min；

步骤6.对浸膏F2.3用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝22/78，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione E保留时间t_R＝38.3min；piterrione F保留时间t_R＝52.4min；

步骤7.对浸膏F3.2.2用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝30/70，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione A保留时间t_R＝15.5min；piterrione D(保留时间t_R＝17.5min)；对浸膏F3.3.4用高压液正相色谱法，色谱柱：welch SiO₂ column,Ultimate,5μm,10×250mm；流动相：正己烷/乙醇＝92/8，流速：2.0mL/min分离得到dihydroaltenuene A(8)保留时间t_R＝34.3min；dihydroaltenuene B(9)保留时间t_R＝38.5min；

步骤8.对浸膏F6.1用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝15/85，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione G保留时间t_R＝20.3min。

2.根据权利要求1所述具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，内生真菌的分离、纯化方法具体步骤为：

先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分；将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10^-1，装入无菌EP管中；混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10^-2，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌。